Name: biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00
Duration: 9 min 38 s
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Gli autori desiderano ringraziare il sostegno della Fondazione Nazionale delle Ricerche (NRF -NRFF2011-01 e NRF2015NRF-POC0001-19), il Consiglio Nazionale delle Ricerche Medical (NMRC / CBRG / 0005/2012), e Nanyang Technological University di NJC

1. Formazione di Supportato doppio strato lipidico su un supporto solido idrofilo <ol><li> Preparare le soluzioni di lipidi azionari di 10 mg / ml di 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (DOPC) e 1 mg / ml di 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - (lissamina rodamina B sulfonile) (Rh-PE) sciogliendo rispettive polveri lipidi (opportunamente pesati preventivamente con bilancio di massa analitico) in soluzione isopropanolo. </li><li> Diluire e mescolare le soluzioni madre in isopropanolo al fine di preparare la miscela lipidica desiderata alla concentrazione finale. Per microscopia a fluorescenza e FRAP esperimenti, 0,5 wt% Rh-PE dovrebbe essere incluso nella miscela lipidica. </li><li> Iniettare la miscela lipidica in isopropanolo nel canale microfluidico fino a riempirlo. </li><li> Incubare la miscela lipidico sulla superficie del vetro per circa 10 min. </li><li> Gradualmente sostituire la soluzione lipidica con acqua o soluzione tampone con una pompa peristaltica ad una portata molto bassa(10-50 ml / min). In alternativa, sostituire la miscela lipidica pipettando ripetuta. </li><li> Risciacquare il canale accuratamente con tampone in eccesso al fine di rimuovere l&#39;isopropanolo residuo. </li></ol> 2. La formazione di membrane supportate colesterolo arricchita Nota: La superficie solida (SiO 2) supporta la fusione delle vescicole, ma la composizione della membrana (colesterolo alto) inibisce la fusione delle vescicole perché vescicole colesterolo alto hanno arricchito la piegatura di rigidità 30. <ol><li> Preparare una soluzione madre contenente 10 mg / ml DOPC lipidi, 10 mg / ml di colesterolo, e 1 mg / ml Rh-PE dapprima sciogliendo le rispettive polveri in isopropanolo. </li><li> Ripetere i passaggi 1,2-1,6 utilizzando le soluzioni madre previste al punto 2.1. </li></ol> 3. fluidità di membrana Assay <ol><li> Immergere il vetrino in una soluzione di sodio dodecil solfato (SDS) (1%) per 10 min. </li><li> Lavare i vetrini con acqua deionizzata e risciacquare ingegnoh etanolo. </li><li> Blow-secco diapositive utilizzando una leggera corrente di azoto. </li><li> Esporre i vetrini a plasma di ossigeno per 30 sec alla massima potenza a radiofrequenza nella camera di plasma di ossigeno. </li><li> Rimuovere lo strato protettivo del fondo commerciale camera di microfluidica (Figura 1A), utilizzando una pinzetta e fissare il vetrino sul lato adesivo della camera (Figura 1B). </li><li> Assemblare i connettori e tubi nelle posizioni di ingresso e uscita della camera e posizionare il canale microfluidico sul palco microscopio (Figura 1C). </li><li> Formare un doppio strato lipidico fluorescenza marcata supportato nel canale microfluidico [ripetere il passaggio 1 utilizzando la composizione lipidica desiderata (ad esempio, 0,5 mg / ml DOPC) compresa 0,5 wt% Rh-PE in solvente organico]. </li><li> Individuare il piano doppio strato con un obiettivo ad immersione 60X (NA 1.49) al fine di catturare le immagini. </li><li> Prendete due immagini pre-candeggina, poi foto-candeggina 301; m di larghezza punto circolare con un raggio laser mW 532 nm, 100. Prima photobleaching, scaldare il laser fino a quando la sua intensità è diventato stabile. Subito dopo photobleaching, catturare una serie di immagini ogni 1 sec per 2 min per seguire la ripresa in intensità di fluorescenza nel punto sbiancato. </li></ol> 4. Colesterolo Quantificazione Assay <ol><li> Esporre il cristallo di quarzo chip del sensore biossido di silicio rivestito al plasma di ossigeno per 30 sec alla massima potenza a radiofrequenza nella camera di plasma di ossigeno. Rimuovere il chip dalla camera e immediatamente montare il chip nella camera di misura. </li><li> Prima esperimento, prima acquisire la frequenza e la dissipazione del chip sensore in aria al fine di garantire un montaggio corretto. <ol><li> Per lo strumento Q-Sense E1 o E4 QCM-D commerciale, eseguire il software Q-Soft e fare clic su &quot;Acquisizione&quot; e selezionare &quot;Setup di misura&quot;. </li><li> Nella nuova finestra che appare, controlla il 3, 5, 7, 9, 11 e 13 toni e quindi scegliere Trova ed eseguire al fine di verificare gli spettri di risonanza. Impostare la temperatura a 24 ° C. Se una o più frequenze di risonanza non sono d&#39;accordo con i valori attesi, controllare il chip di montaggio e ri-eseguire questo passaggio fino al raggiungimento di un accordo. </li></ol></li><li> Avviare la pompa peristaltica e portata della soluzione tampone (10 mM Tris, NaCl 150 mM, pH 7,5) nella camera di misura ad una portata di 100 l / min. </li><li> Nel programma software, fare clic &quot;Acquisizione&quot; e selezionare &quot;Restart di misura&quot; al fine di registrare i segnali di dissipazione di frequenza di risonanza e di energia. Ripetere questa operazione fino ad ottenere una linea di base stabile per gli spostamenti di frequenza e di dissipazione. Nota: Per i passaggi di seguito, ci sarà di frequenza e dissipazione turni aggiuntivi che possono essere registrati in funzione del tempo. </li><li> Iniettare isopropanolo (senza lipidi) per 10 minuti. </li><li> Iniettare la miscela di DOPC lipidi / colesterolo alrapporto molare desiderato con una concentrazione di lipidi totale di 0,5 mg / ml in isopropanolo per 10 min. </li><li> Iniettare buffer per 20 min ad una portata di 100 l / min. </li><li> Iniettare una soluzione di 1-metil mM β-ciclodestrina (MβCD) preparato in tampone (portata 100 l / min) fino a quando il segnale di frequenza raggiunge un valore stabile. </li><li> Misurare i relativi spostamenti di frequenza positivo che è causato dalla fase di trattamento MβCD e calcolare la massa dei lipidi e del colesterolo DOPC convertendo i valori Af cho e Af DOPC ai valori di massa utilizzando l&#39;equazione di Sauerbrey [Δm = - (C / n) × Af, dove C = 17,7 ng / cm 2, n: armonico]. </li><li> Calcolare la frazione molare di colesterolo nel SLB, tenendo conto dei pesi molecolari di DOPC lipidi (786,1 g / mol) e colesterolo (386.6 g / mol). </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

In questo lavoro, un protocollo solvente cambio è presentato in cui lipidi in alcool (isopropanolo, etanolo, o n-propanolo) vengono incubati con un supporto solido e quindi l&#39;alcool viene sostituito gradualmente, con una soluzione tampone acquosa al fine di guidare una serie delle transizioni di fase alla fine la produzione di lamellare trifase doppi strati lipidici 24. E &#39;dimostrato che il metodo consente la produzione di bistrati lipidici supportati su superfici quali oro, che è intrattabile al metodo fusione delle vescicole. Un intervallo di concentrazione lipidica ottimale (0,1 - 0,5 mg / ml) è stato determinato per la formazione completa in doppio strato formati sperimentali serie testati finora. A concentrazioni di lipidi di sotto di 0,1 mg / ml, discreti, macchie microscopiche di doppi strati formata. D&#39;altra parte, a concentrazioni superiori a 0,1 mg / ml e inferiore a 0,5 mg / ml, un doppio strato completo ed uniforme è formato. A concentrazioni lipidiche sopra di questo range, un doppio strato liquido era ancora formato come verificato mediante analisi FRAP, tuttavia, microscopia a fluorescenza rivela la presenza di strutture lipidiche aggiuntivi superiore del doppio strato. Sorprendentemente, la morfologia di queste strutture lipidiche supplementari, come determinato mediante analisi QCM-D, dipendeva l&#39;alcool che è stato utilizzato durante la fase di incubazione. Nel caso dell&#39;etanolo, relativamente elevate Δ turni F e D Δ assomigliano alla firma QCM-D ottenuto per uno strato vescicole adsorbito. Quando è stato invece utilizzato isopropanolo o n-propanolo, il Δ f era leggermente superiore al valore previsto per un doppio strato (finale Δ f tra -30 a -40 Hz), mentre il Δ D era sensibilmente superiore. Tali risposte QCM-D sono attese per strutture lipidiche estesi (ad esempio, micelle vermiformi) sporgenti verso l&#39;esterno dalla superficie della membrana (come visibile al microscopio a fluorescenza in alcuni casi). Il tasso di cambio solvente è un altro parametro importante, che può essere critico, especbuona resa quando si utilizzano concentrazioni di lipidi inferiore (ad esempio, 0,1 mg / ml). Rapido scambio solvente bassa concentrazione di lipidi può portare alla formazione di doppi strati incompleti. Nella camera di misura standard utilizzato per le misure QCM-D in questo documento (Q-Sense E4 camera di misura), portata di circa 100 ml / min, sono adatti per la formazione di doppio strato altamente riproducibile completa. Per celle di flusso con altre geometrie e di volume, la portata ottimale può variare e deve essere determinato empiricamente sulla base dei passi suggeriti qui. Oltre a formare bistrati lipidici supportati su superfici intrattabile a fusione della vescicola, il SALB può essere impiegato per aggirare la necessità di vescicole lipidiche che possono rompersi, aprendo così la porta alla fabbricazione di membrane supportate con composizioni complesse. Come esempio illustrativo composizione, sono stati esaminati miscele lipidiche con un&#39;elevata frazione di colesterolo. Il colesterolo è una componente importante di mammalian membrane cellulari, e la sua frazione possono avvicinarsi 45-50 moli% della composizione dei lipidi di membrana (ad esempio, negli eritrociti). Così, anche un semplice modello di un doppio strato lipidico che rappresenta una membrana cellulare umana dovrebbe includere colesterolo. Mentre vescicole fusione potrebbe essere usato per fabbricare bistrati lipidici fluidici contenenti solo il 10-15% di colesterolo, il metodo consente SALB formazione di bistrati lipidici fluidici contenenti elevate frazioni di colesterolo (fino a 57% in moli, come quantificato mediante misure QCM-D) 36. Tuttavia, quando il livello di colesterolo è ulteriormente elevata (fino a 63% in moli), domini striati figura 37 sono stati osservati. I domini coesistenti erano liquido, ricordano quelli osservati nella regione β nel diagramma di fase del colesterolo / fosfolipidi monostrato all&#39;interfaccia aria-acqua. In generale, il metodo SALB è dimostrato di essere un metodo semplice ed efficace per formare bistrati lipidici supportati, in particolare in casi al di là del campo di applicazione del metodo di fusione delle vescicole convenzionale. Finora, la tecnica e la microscopia a fluorescenza QCM-D sono stati utilizzati principalmente per caratterizzare i doppi strati lipidici supportati formati con il metodo SALB. Guardando al futuro, una vasta gamma di misure analitiche tecniche di superficie sensibile, tra cui risonanza plasmonica di superficie (SPR) 38, microscopia a forza atomica (AFM) 39,40, trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa 41, a raggi X 42 e neutroni riflettività 43 può, essere utilizzato per caratterizzare ulteriormente e studiare configurazioni semplici e complesse doppio strato preparano con il metodo SALB. Queste capacità emergenti aprono la porta ad un maggior numero di scienziati che possono esplorare le membrane cellulari artificiali, approfittando di un protocollo sperimentale semplice e robusto.

Il solido supportato doppio strato lipidico 1 (SLB) è una piattaforma versatile che conserva le caratteristiche di base di biomembrane quali lo spessore doppio strato, bidimensionale diffusività lipidi, e la possibilità di ospitare biomolecole associate alla membrana. A causa della complessità delle membrane cellulari naturali, questa semplice piattaforma ha dimostrato di funzionare come una piattaforma efficiente per studi in vitro di processi a membrana correlati come la formazione zattera 2, proteina legante 3, virus e particelle simili a virus di legame 4,5 , e la segnalazione a 6 celle. Formata in prossimità di un supporto solido, la piattaforma SLB è compatibile con una serie di misure tecniche di superficie sensibile come la microscopia a riflessione interna totale (TIRF), cristallo di quarzo microbilancia-dissipazione (QCM-D), e spettroscopia di impedenza. Diversi metodi sono stati sviluppati per la produzione di diversi tipi di SLB, compreso bolla d&#39;ariacrollo 7 e dip-pen nanolitografia 8 per macchie di lipidi submicron dimensioni,-spin coating 9 per gli stack doppio strato e Langmuir-Blodgett (LB) 10 e la fusione delle vescicole (VF) 11 per full-spanning, rivestimenti singolo doppio strato lipidico. Il metodo consiste VF dell&#39;adsorbimento di piccole vescicole unilamellari ad un supporto solido e la successiva rottura spontanea e fusione per formare un doppio strato lipidico continuo. Tuttavia, in condizioni fisiologiche, rottura delle vescicole spontanea è limitata principalmente ai materiali a base di silicio, quali biossido di silicio, vetro, e mica. Inoltre, la rottura delle vescicole non avviene spontaneamente per vescicole lipidiche di composizioni complesse come quelle contenenti alte frazioni di colesterolo o lipidi carichi negativamente. A seconda del sistema, la rottura delle vescicole può essere indotta da ulteriormente adattando le condizioni sperimentali quali temperatura 12, soluzione pH 13, e 14 salinità, shock osmotico 15 </sup&gt; o di pressione 16, o l&#39;aggiunta di ioni bivalenti come Ca2 + 17. In alternativa, la membrana attiva AH peptide può essere introdotto per destabilizzare uno strato di vescicole adsorbite, che porta alla rottura della vescicola e formazione bistrato su una serie di superfici 18-22. Inoltre, la formazione di doppio strato di successo richiede la preparazione di una popolazione ben controllata di piccole vescicole unilamellari che può richiedere molto tempo e difficile da realizzare per certe composizioni membrana. Pertanto, nonostante la sua elevata efficienza in casi ottimali (ad esempio, dopo ampia congelamento-scongelamento pretrattamento di vescicole 23), l&#39;applicazione generale fusione della vescicola è limitata dalla portata di substrati adatti e composizioni membrana. Il metodo 24-28 assistita solvente doppio strato lipidico (SALB) è una tecnica di fabbricazione alternativa che non richiede vescicole lipidiche. Il metodo si basa sulla deposizione omolecole lipidiche f SU UN superficie solida, in presenza di un solvente organico miscibile acqua seguita da graduale scambio di questo solvente con una soluzione tampone acquoso al fine di innescare la formazione di SLB. Durante la fase solvente di cambio, la miscela ternaria di lipidi, solvente organico e acqua subisce una transizione di fase serie con crescente frazione acquosa, che porta alla formazione di strutture lamellari di fase nella soluzione di massa e una SLB sul substrato solido. È importante sottolineare che questo percorso autoassemblaggio bypassa la necessità per la rottura delle vescicole, che è di solito il fattore limitante per la trasformazione di vescicole adsorbite in un SLB. Il protocollo è applicabile ad un&#39;ampia varietà di superfici e biossido di silicio, ossido di alluminio, cromo, ossido di indio-stagno, e oro. In questo documento e nel video allegato, un confronto tra la deposizione di lipidi dal SALB e metodi vescicole fusione è presentato. In particolare, l&#39;influenza dei parametri sperimentali, compresa la concentrazione di lipidi, Portata, e la scelta del solvente organico miscibile in acqua, sulla qualità del doppio strato costituito dal metodo SALB sono discussi. Caratterizzazione analitica dei fabbricati SLB è eseguita dal QCM-D, microscopia a fluorescenza, e recupero di fluorescenza dopo photobleaching tecniche (FRAP). Monitoraggio QCM-D è una tecnica di misurazione massa superficiale-sensibile, che, dal momento che il lavoro pionieristico svolto da Keller e Kasemo 29, è stato ampiamente utilizzato per studiare quantitativamente formazione doppio strato. Microscopia a fluorescenza permette l&#39;ispezione della membrana omogeneità e la visualizzazione dei domini di membrana. La tecnica FRAP è uno strumento standard per determinare la mobilità laterale di molecole lipidiche in una SLB, che è una proprietà essenziale delle membrane fluidici. La prima parte di questo studio prevede l&#39;analisi QCM-D del SALB e metodi di fusione delle vescicole applicata per tentare formazione doppio strato di diossido di silicio e oro. Nella seconda parte,preparazione e caratterizzazione di membrane supportate contenenti una gamma di concentrazioni di colesterolo con il metodo SALB sono dimostrati ei risultati sono confrontati con quelli ottenuti con il metodo di fusione delle vescicole.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1459">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QCM-D gold-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Sense E4 module</td>
			<td>QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plasma Cleaner, PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-001 (115V)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:217px;">700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:217px;">C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">673773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">n-propanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">279544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sticky-Slide I 0.1 Luer</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">81128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Male elbow 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:356px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:217px;">30505-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Silicon tubing 1.6mm ID</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:356px;">Ismatec</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">71725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

Al fine di simulare le membrane delle cellule, il doppio strato lipidico supportato (SLB) è una piattaforma interessante che permette nelle indagini vitro dei processi a membrana legati mentre conferendo biocompatibilità e biofunzionalità a substrati solidi. L&#39;adsorbimento spontanea e la rottura di vescicole fosfolipidiche è il metodo più comunemente utilizzato per formare SLB. Tuttavia, in condizioni fisiologiche, la fusione delle vescicole (VF) è limitato ad un solo sottoinsieme di composizioni lipidiche e supporti solidi. Qui, si descrive una procedura generale a fase unica definito il metodo di formazione assistita solvente doppio strato lipidico (SALB) per formare SLB che non richiede vescicole. Il metodo SALB comporta la deposizione di molecole lipidiche su una superficie solida, in presenza di solventi organici miscibili con acqua (ad esempio, isopropanolo) e successiva solventi scambio con soluzione tampone acquosa al fine di innescare la formazione di SLB. La fase solvente scambio continuo consente l&#39;applicazione dellaMetodo in una configurazione a flusso adatto per la formazione di monitoraggio doppio strato e successive modifiche utilizzando una vasta gamma di biosensori superficie sensibile. Il metodo può essere usato SALB per fabbricare SLB su un&#39;ampia gamma di superfici solide idrofili, compresi quelli che sono intrattabili di fusione della vescicola. Inoltre, consente la fabbricazione di SLB composto da composizioni lipidiche, che non possono essere preparate con il metodo fusione delle vescicole. Qui, mettiamo a confronto i risultati ottenuti con i metodi di fusione delle vescicole SALB e convenzionali su due superfici idrofile illustrativo, biossido di silicio e oro. Per ottimizzare le condizioni sperimentali per la preparazione di bistrati alta qualità preparati tramite il metodo SALB, l&#39;effetto di vari parametri, tra cui il tipo di solvente organico nella fase di deposizione, il tasso di cambio solvente e la concentrazione di lipidi è discusso con risoluzione dei problemi . La formazione di membrane supportate contenenti elevate frazioni di colesterolo è anche demonitrattato con il metodo SALB, evidenziando le capacità tecniche della tecnica SALB per una vasta gamma di configurazioni di membrana.

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Presentiamo un protocollo sperimentale per formare un doppio strato lipidico supportato su substrati solidi senza utilizzare vescicole lipidiche. Si dimostra un metodo di uno stadio per formare un doppio strato lipidico di diossido di silicio e oro così come membrane supportate con dominio colesterolo arricchita per varie applicazioni biologiche.

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