Name: biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00
Duration: 9 min 38 s
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저자는 NJC에 국립 연구 재단 (NRF -NRFF2011-01과 NRF2015NRF-POC0001-19), 국립 의료 연구위원회 (NMRC / CBRG / / 2012 0005), 그리고 난양 기술 대학에서 지원을 인정하고자하는

친수성 고체 지지체에 지원되는 지질 이중층 1. 형성 <ol><li> 10 ㎎ / ㎖의 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 지질 스톡 용액을 제조 (DOPC) 1 ㎎ / ㎖의 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N - (리사 민 로다 민 B 각 지질 분말을 용해시켜 술 포닐) (RH-PE)는 (적절히 이소프로판올 용액의 분석 질량 균형)을 미리 칭량. </li><li> 희석하고, 최종 농도 원하는 지질 혼합물을 제조하기 위해 이소프로판올 스톡 용액을 혼합한다. 형광 현미경 및 FRAP 실험, 0.5 중량 % RH-PE는 지질 혼합물을 포함한다. </li><li> 이 채워질 때까지 미세 유체 채널로 이소프로판올 지질 혼합물을 주입한다. </li><li> 약 10 분 동안 유리 표면에 지질 혼합물을 배양한다. </li><li> 서서히 매우 낮은 유속으로 연동 펌프를 사용하여 물 또는 완충액과 지질 용액을 대체(10 ~ 50 μL / 분). 또한, 반복 피펫에 의한 지질 혼합물을 교체합니다. </li><li> 잔류 이소프로판올을 제거하기 위해 과량의 완충액으로 철저하게 채널을 헹군다. </li></ol> 콜레스테롤이 풍부한 지원 막 2. 형성 참고 : 고체 표면 (SiO2를하면) 소포 융합을 지원하지만 콜레스테롤이 풍부한 소포는 높은 강성 (30) 굽힘 때문에 막 조성 (고 콜레스테롤) 소포 융합을 억제한다. <ol><li> 제 이소프로판올 각 분말을 용해시켜 10 ㎎ / ㎖의 DOPC 지질, 10 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤, 1 ㎎ / ㎖ RH-PE를 함유하는 스톡 용액을 제조 하였다. </li><li> 반복 2.1 단계에서 제조 된 원액을 사용하여 1.2-1.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 3. 막 유동성 분석 <ol><li> 10 분 동안 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 용액 (1 %)의 유리 슬라이드를 담근다. </li><li> 탈 이온수로 철저하게 슬라이드를 세척하고 재치 린스시간 에탄올. </li><li> 불어 건조 질소의 부드러운 흐름을 사용하여 슬라이드를. </li><li> 산소 플라즈마 챔버에서 최대 무선 주파수 전력에서 30 초 동안 산소 플라즈마에 노출 슬라이드. </li><li> 밑 상업 미세 유체 챔버 (그림 1A)의 보호 필름 코팅 트위터를 사용하여 제거하고 챔버 (그림 1B)의 접착면에 유리 슬라이드를 연결합니다. </li><li> 챔버의 입구와 출구의 위치에 커넥터와 튜브를 조립하고 현미경 단계 (그림 1C)에 미세 유체 채널을 배치합니다. </li><li> 미세 유체 채널의 형광 표지 된 지원 지질 이중층 형성 [바람직한 지질 조성물을 사용하여 반복 스텝 (1) (예, 0.5 ㎎ / ㎖ DOPC) 0.5 중량 % RH-PE 유기 용매를 포함]. </li><li> 이미지를 캡처하기 위해 60X 기름 침지 목표 (NA 1.49)와 이중층 평면을 찾습니다. </li><li> 두 사전 표백제 이미지를 가지고, 다음 (30) 사진 - 표백1, 532 nm의, 100 mW의 레이저 빔으로 넓은 원형의 자리를 해요. 그 강도가 안정 될 때까지 photobleaching에 전에 레이저를 따뜻하게. photobleaching에 바로 후 표백 지점에서 형광 강도의 복구를 수행하기 위해 2 분 동안 1 초마다 일련의 이미지를 캡쳐. </li></ol> 4. 콜레스테롤 정량 분석 <ol><li> 산소 플라즈마 챔버에서 최대 무선 주파수 전력에서 30 초 동안 산소 플라즈마에 실리콘 이산화물 코팅 된 석영 결정 센서 칩을 노출. 챔버로부터 칩을 분리하고 즉시 측정 챔버에 칩을 마운트. </li><li> 실험 전에 먼저 적정 부착을 보장하기 위해 공중에 센서 칩의 주파수 및 분산을 획득. <ol><li> 상업 Q 감지 E1 또는 E4 QCM-D 악기를 들어, Q-소프트 소프트웨어 프로그램을 실행하고 &quot;취득&quot;버튼을 클릭 &quot;설정 측정&quot;을 선택합니다. </li><li> 표시되는 새 창에서, 3, 5, 7을 확인, 9, 11, 13 배음 다음 찾기 및 공명 스펙트럼을 확인하기 위해 실행을 클릭합니다. (24)에서 온도를 설정 기음. 하나 또는 그 이상의 공진 주파수가 예상 된 값과 일치하지 않는 경우, 칩 탑재를 확인하고 합의에 도달 할 때까지이 과정을 다시 수행한다. </li></ol></li><li> 연동 펌프를 시작하고, 100 μL / 분의 유속으로 상기 측정 챔버 내에 완충액 (10 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)를 흐른다. </li><li> 소프트웨어 프로그램에서 &quot;취득&quot;버튼을 클릭 공진 주파수와 에너지 소비 신호를 기록하기 위해 &quot;다시 측정&quot;을 선택합니다. 안정된 기준은 주파수와 소비 변화에 대해 얻을 때까지이 단계를 반복합니다. 참고, 시간의 함수로서 기록 될 수있는 추가 주파수 및 소산 교대있을 것이다 이하 단계는. </li><li> 10 분 동안 (지질 제외) 이소프로판올을 주입한다. </li><li> DOPC에서 지질 / 콜레스테롤 혼합물을 주입10 분간 이소프로판올에 0.5 ㎎ / ㎖의 총 지질 농도와 원하는 몰비. </li><li> 100 μL / 분의 유속으로 20 분 동안 버퍼를 주입. </li><li> 버퍼 (레이트 100 μL / 분으로 흐름) 주파수 신호가 안정된 값에 도달 할 때까지 준비 1mM의 메틸 - β - 시클로 덱스트린 (MβCD)의 용액을 주입한다. </li><li> MβCD 처리 공정에 의해 야기되는 상대적으로 양의 주파수 변화를 측정하고 [ΔM = 사우어 브레이 식을 이용하여 질량 값 Δf에 CHO 및 Δf에 DOPC 값을 변환하여 콜레스테롤 및 DOPC 지질의 질량을 계산 - (C / N) × ΔF, 여기서 C = 17.7 NG / cm 2, N : 상음]. </li><li> 고려 DOPC 지질 (786.1 g / mol) 및 콜레스테롤 (386.6 g / 몰)의 분자량을 가지고, SLB 콜레스테롤의 몰분율을 계산한다. </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

이 작업에서, 용제 - 교환 프로토콜은 고체 지지체에 배양 알코올 (이소프로판올, 에탄올 또는 n- 프로판올)에있는 지질로 표시 한 후 알코올 시리즈를 구동하기 위해 수성 완충액으로 점차 대체 위상 천이 결국 라멜라 상 지질 이중층 (24)의 제조. 이 방법은 소포 융합 방법에 난치성 인 금,은 등의 표면에 담지 된 지질 이중층의 제조를 가능하게하는 것이 도시되어있다. 최적의 지질 농도 범위 (0,1 - 0,5 ㎎ / ㎖)는 지금까지 시험 표준 실험에서 완전한 포맷 이중층 형성을 위해 결정되었다. 이중층의 0.1 ㎎ / ㎖, 이산 미세한 패치 아래 지질 농도로 형성했다. 한편, 0.1 ㎎ / ㎖ 이상의 농도에서 및보다 낮은 0.5 ㎎ / ㎖, 완전하고 균일 이중층이 형성된다. 이 범위보다 지질 농도, 유체 이중층 여전히 검증기로 형성 하였다FRAP 분석하여 에드 그러나, 형광 현미경은 이중층 위에 추가적인 지질 구조의 존재를 드러낸다. QCM-D 분석에 의해 결정되는 바와 같이 현저하게, 이러한 추가 지질 구조체의 형태는 배양 단계 동안 사용 된 알코올에 의존. 에탄올의 경우, 상대적으로 높은 F Δ와 Δ D 변화는 흡착 층 소포 얻어 QCM-D 서명을 닮은. 이소프로판올 또는 n- 프로판올 대신 사용한 경우 Δ D가 상당히 높았다, Δ의 F는, 이중층 (-30 Hz에서 -40 사이의 최종 Δ F)에 대한 기대 값보다 약간 높았다. 이러한 QCM-D 응답은 (어떤 경우에는 형광 현미경으로 보이는)을 막 표면으로부터 외측으로 돌출되어 연장 된 지질 구조체 (예를 들어, 웜 형상 미셀)을 위해 예상된다. 용매의 환율은 ESPEC, 중요 할 수있는 또 다른 중요한 변수이다낮은 지질 농도 (예, 0.1 ㎎ / ㎖)을 사용하는 경우 ially. 낮은 지질 농도의 빠른 용매 교환은 불완전 이중층의 형성으로 이어질 수 있습니다. 본 논문에서는 QCM-D 측정치 (Q 감지 E4 측정 챔버), 약 100 μL / 분의 유동 속도를 위해 사용되는 표준 측정 챔버 내에, 높은 재현성 완전한 이중층 형성에 적합 하였다. 다른 형상 및 부피 유동 세포, 최적의 유량은 변할 수 있고, 본 명세서에서 제안 된 실험적 단계에 기초하여 결정되어야한다. 소포 융합 난치성이다 표면에 담지 된 지질 이중층을 형성 할뿐만 아니라, SALB시켜 복합 조성물 지원 막의 제조의 문을 열고, 파열 수 지질 소포에 대한 필요성을 회피하는 데 사용될 수있다. 예시 조성물로서, 콜레스테롤의 높은 비율과 지질의 혼합물을 조사 하였다. 콜레스테롤 mamm의 중요한 구성 요소알랸 세포막, 및 분획 (적혈구, 예), 막 지질 조성의 45 ~ 50 몰 %에 접근 할 수있다. 따라서, 인간 세포막을 나타내는 지질 이중층 심지어 간단한 모델은 콜레스테롤을 포함한다. 소포 융합은 10-15 %의 콜레스테롤을 함유하는 유체의 지질 이중층을 제조하는데 사용될 수 있지만 36 (QCM-D의 측정에 의해 정량으로, 57 몰 % 이하), SALB 방법은 콜레스테롤이 높은 분획을 함유하는 유체의 지질 이중층의 형성을 가능하게한다. 콜레스테롤의 수준이 더 (63 몰 % 이하) 승온 그러나, 스트라이프 형상 영역 (37)을 관찰 하였다. 공존 도메인은 공기 - 물 계면에서 콜레스테롤 / 인지질 단층의 상태도에서 β 영역에서 관찰되는 연상 액체였다. 전체적으로 SALB 방법은 내가 특히, 지원되는 지질 이중층을 형성하는 간단하고 효율적인 방식으로 도시되어있다종래 소포 융합 방법의 범위를 벗어나는 경우, N. 지금까지 QCM-D 기술과 형광 현미경 주로 SALB 법에 의해 형성된지지 지질 이중층을 특성화하기 위해 사용되었다. 기대, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (38), 원자력 현미경 (AFM) (39, 40)를 포함하여 표면 성 분석 측정 기법의 넓은 범위가, 적외선 분광기 (41)를 푸리에 변환, X 선 (42) 및 중성자 반사율 43 수 상기 특성화 및 단순 및 복합 이중층 구성 SALB 방법에 의해 제조 연구하는 데 사용할. 이 새로운 기능은 간단하고 강력한 실험 프로토콜을 이용하여 인공 세포막을 탐색 할 수 있습니다 과학자의 더 많은 수의 문을 엽니 다.

고체지지 지질 이중층 1 (SLB)은 이러한 이중층 두께, 이차원 확산 지질 및 막 - 관련 생체 분자를 호스팅 할 수있는 능력으로 생체막의 기본 특성을 보존 다목적 플랫폼이다. 자연적인 세포막의 복잡성이 간단한 플랫폼 (3), 바이러스 및 바이러스 유사 입자는 4,5- 결합을 결합 등 뗏목 형성 2 단백질로서 세포막 관련 프로세스의 시험 관내 연구를위한 효율적인 플랫폼으로서 기능하는 것으로 나타났다 및 셀 (6) 신호. 고체 지지체에 근접하여 형성된, SLB 플랫폼은 전반사 현미경 (TIRF), 수정 진동자 마이크로 밸런스 방산 (QCM-D), 및 임피던스 분광법으로 표면 성 측정 기술의 범위와 호환된다. 몇몇 방법은 기포를 포함 SLB 수의 다른 유형을 생성하기 위해 개발되어왔다서브 마이크론 크기의 지질 명소에 대한 붕괴 7 딥 - 펜 나노 리소그래피 (8), 스핀 코팅 이중층 스택과 랭 뮤어 - 블로 젯 (LB) (10) 및 풀 스패닝, 하나의 지질 이중층 코팅 소포 융합 (VF) 11 9. VF 방법은 연속 지질 이중층을 형성하도록 고체 지지체 이후 자발 파열과 융합 소형 단일 층 소포 흡착 이루어져있다. 그러나, 생리 학적 조건 하에서 자발적 소포 파괴는 주로 이산화 규소, 유리, 운모 등의 실리콘계 재료로 한정된다. 또한, 소포 파열은 콜레스테롤 또는 음으로 하전 된 지질의 높은 분획을 함유하는 것과 같은 복잡한 지질 조성물의 소포에 대해 자발적으로 발생하지 않는다. 시스템에 따라, 소포 파열은 또한 온도 12 용액의 pH를 13, 14 및 염분, 삼투압 충격 (15)와 같은 실험 조건을 조정하여 유도 될 수있다 </s압력 (16), 또는 칼슘과 같은 가의 이온 첨가 닫&gt; 또는 (17). 대안 적으로, 막 - 활성 AH 펩티드의 범위에 소포 파열 이중층 형성 선도 흡착 소체 층을 불안정하게하기 위해 도입 될 수있다 18-22면. 또한, 성공적인 이중층 형성 시간과 특정 막 조성물을 달성하기 어려울 수있다 소형 단일 층 소포 잘 조절 집단의 제조를 필요로한다. 따라서, 최적의 경우에 높은 효율에도 불구하고 (예를 들면, 소체 (23)의 동결 - 해동 광범위한 전처리 후), 소포 융합의 일반적인 애플리케이션은 적절한 기판과 막 조성물의 범위에 의해서만 한정된다. 용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법 24-28 지질 소포를 필요로하지 않는 다른 제조 기술이다. 이 방법은 증착 O에 기초SLB 형성을 유발하기 위해 수성 완충액이 용매의 점진적인 교환 하였다 수혼 화성 유기 용매의 존재하에 고형 표면 상 F 지질 분자. 용매 교환 단계, 지질, 유기 용매의 삼원 혼합물, 및 물 중에 벌크 용액 라멜라 상 구조 형성 및 고체 기판에 SLB 리드 물 분율 증가와 직렬 위상 천이를 겪는다. 중요한 것은,이 자기 ​​조립 행은 일반적으로 흡착 SLB 소체의 변환을위한 제한 단계이다 소포 파열에 대한 요구를 무시. 프로토콜은 이산화 규소, 산화 알루미늄, 크롬, 인듐 주석 산화물, 및 금을 포함하여 다양한 표면에 적용될 수있다. 본 논문에서는 첨부 영상에서 SALB 및 소포 융합 방법에 의해 지질 침착의 비교를 제시한다. 특히, 실험적인 매개 변수의 영향을 포함한 지질 농도, 유량 및 SALB 방법에 의해 형성된 이중층의 품질에 수혼 화성 유기 용매의 선택은, 논의된다. 제작 SLB 수의 분석 특성화 (FRAP) 기법 photobleaching에 후 QCM-D, 형광 현미경, 형광 회복에 의해 수행된다. QCM-D 모니터링 켈러와 Kasemo (29)에 의해 수행 된 선구적인 작업부터, 광범위하게 정량적으로 이중층 형성을 조사하기 위해 사용 된, 표면에 민감한 질량 측정 기술이다. 형광 현미경은 막 균일 성 검사뿐만 아니라 멤브레인 도메인의 시각화를 허용한다. FRAP 기술은 유체 막의 필수 속성 인 SLB, 지질 분자의 측방 이동을 결정하는 표준 도구이다. 본 연구의 첫 번째 부분은 실리콘 이산화물과 금에 이중층을 형성하도록 시도인가 SALB의 QCM-D 분석과 소포 융합 방법을 포함한다. 두 번째 부분에서는,준비 및 SALB 법 콜레스테롤 농도 범위를 함유하는지지 막의 특성이 입증되고, 결과는 소포 융합 방법에 의해 수득 된 것과 비교한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1459">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QCM-D gold-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Sense E4 module</td>
			<td>QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plasma Cleaner, PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-001 (115V)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:217px;">700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:217px;">C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">673773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">n-propanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">279544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sticky-Slide I 0.1 Luer</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">81128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Male elbow 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:356px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:217px;">30505-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Silicon tubing 1.6mm ID</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:356px;">Ismatec</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">71725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

세포막을 모방하기 위해,지지 지질 이중층 (SLB)는 고체 기판에 biofunctionality 생체 적합성을 부여하면서 막 - 관련 프로세스의 체외 조사 가능 매력적인 플랫폼이다. 인지질 소포체의 자발적 흡착 및 파열 SLB 수를 형성하는 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 그러나, 생리 학적 조건 하에서, 소포 융합 (VF)는 지질 조성물 및 고체 지지체의 서브 세트로 제한된다. 여기서는 소체를 필요로하지 않는다 SLB 수를 형성하기 위해서 용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 형성 방법이라고 한 단계 반응 절차를 설명한다. SALB 방법은 SLB 형성을 유발하기 위해 수혼 화성 유기 용매 (예 : 이소프로판올) 및 수성 완충 용액으로 교환 후속 용매의 존재하에 고형 표면에 지질 분자의 침착을 포함한다. 연속 용매 교환 단계의 적용을 가능하게모니터링 이중층 형성 및 표면 성 바이오 센서의 넓은 범위를 사용하여 후속의 변경에 적합한 관류 구성 방법. SALB 방법은 소포 융합되는 난치성 포함한 친수성 ​​고체 표면의 광범위한 SLB 수를 제조 할 수있다. 또한, 소포 융합 방법을 사용하여 제조 할 수없는 지질 조성물로 이루어지는 SLB 수의 제조를 가능하게한다. 여기서, 우리는 두 가지 예시 친수성 ​​표면, 이산화 규소 및 골드 SALB 종래 소포 융합 방법으로 얻어진 결과를 비교. SALB 방법을 통해 제조 된 고품질의 이중층의 제조를위한 실험 조건을 최적화하기 위해, 성막 공정에서의 유기 용제의 종류, 용매 교환의 속도 및 지질 농도를 포함하는 다양한 파라미터의 효과가 해결 정보와 함께 논의 . 콜레스테롤이 높은 분획을 함유하는지지 막의 형성도이다 귀신막 구성의 광범위한 SALB 기술의 기술 능력을 강조 SALB 방법으로 보이는 것.

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

우리는 지질 소포를 사용하지 않고 고체 기판 상에지지 지질 이중층을 형성하는 실험 프로토콜을 제시한다. 우리는 다양한 생물학적 응용을위한 콜레스테롤이 풍부한 도메인과 지질 이산화 규소 및 골드 이중층뿐만 아니라지지 막을 형성하는 하나의 단계 방법을 보여준다.

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