Name: biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00
Duration: 9 min 38 s
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Os autores gostariam de agradecer o apoio da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF -NRFF2011-01 e NRF2015NRF-POC0001-19), o Conselho Nacional de Pesquisa Médica (NMRC / CBRG / 0005/2012), e Universidade Tecnológica de Nanyang para NJC

1. Formação da bicamada lipídica suportados sobre um suporte sólido Hidrofílico <ol><li> Preparar soluções de lípido de 10 mg / ml de 1,2-sn-glicero-dioleoyl- 3-fosfocolina (DOPC) e 1 mg / ml de 1,2-sn-glicero-dioleoyl- 3-phosphoethanolamine- N - (lissamina rodamina B sulfonil) (Rh-PE) por dissolução dos respectivos pós de lípidos (devidamente pesado previamente com um balanço de massa analítica) em solução de isopropanol. </li><li> Dilui-se e misturar as soluções de reserva em isopropanol a fim de preparar a mistura de lípidos desejada na concentração final. Para a microscopia de fluorescência e FRAP experiências, 0,5% em peso de Rh-PE deve ser incluído na mistura lipídica. </li><li> Injectar a mistura de lípidos em isopropanol para dentro do canal microfluídico até que seja preenchido. </li><li> Incubar a mistura de lípidos na superfície de vidro durante cerca de 10 min. </li><li> Substituir gradualmente a solução de lipidos com água ou solução de tampão utilizando uma bomba peristáltica a um caudal muito baixo(10-50 ul / min). Alternativamente, substituir a mistura de lípidos por pipetagem repetida. </li><li> Enxaguar minuciosamente o canal com o tampão em excesso, de modo a remover o isopropanol residual. </li></ol> 2. formação das membranas suportadas enriquecidas com colesterol Nota: A superfície sólida (SiO2) apoia fusão de vesícula, mas a composição da membrana (colesterol alto) inibe a fusão das vesículas porque vesículas enriquecidas com colesterol têm alta rigidez de flexão 30. <ol><li> Prepara-se uma solução de reserva contendo 10 mg / ml de lípido DOPC, 10 mg / ml de colesterol, e 1 mg / ml de Rh-PE dissolvendo em primeiro lugar os respectivos pós em isopropanol. </li><li> Repita os passos 1,2-1,6 utilizando as soluções de reserva preparada no passo 2.1. </li></ol> 3. Fluidez de Membrana Assay <ol><li> Imergir a lâmina de vidro na solução de sulfato de dodecil de sódio (SDS) (1%) durante 10 min. </li><li> Lavar as lâminas cuidadosamente com água deionizada e lave sagacidadeh etanol. </li><li> Seque slides usando uma corrente suave de azoto. </li><li> Expor os slides a plasma de oxigênio durante 30 segundos à potência máxima de radiofreqüência na câmara de plasma de oxigênio. </li><li> Remova o revestimento de película protetora do fundo comercial câmara microfluídicos (Figura 1A), usando uma pinça e coloque a lâmina de vidro para o lado pegajoso da câmara (Figura 1B). </li><li> Montar os conectores e tubagens para as posições de entrada e de saída da câmara e colocar o canal microfluídico na platina do microscópio (Figura 1C). </li><li> Formar uma bicamada lipídica fluorescentemente marcado suportado no canal microfluídico [repetir o passo 1, utilizando a composição de lípido desejada (por exemplo, 0,5 mg / ml de DOPC), incluindo 0,5% em peso de Rh-PE em solvente orgânico]. </li><li> Localizar o plano da bicamada com uma objectiva de imersão em óleo de 60X (NA 1.49), a fim de capturar as imagens. </li><li> Tome duas imagens pré-branqueamento, em seguida, foto-branqueador a 301; m de largura ponto circular com um feixe de laser de 532 nm mW, 100. Antes de fotodegradação, aquecer o laser até sua intensidade tornou-se estável. Imediatamente após a fotodegradação, captar uma série de imagens a cada 1 s durante 2 minutos, a fim de seguir a recuperação da intensidade de fluorescência no local branqueada. </li></ol> 4. O colesterol Quantificação Assay <ol><li> Expor o chip sensor de silício de cristal de quartzo revestido de dióxido de plasma de oxigénio durante 30 segundos à potência máxima de radiofrequência na câmara de plasma de oxigénio. Remover o chip da câmara e imediatamente montar o chip na câmara de medição. </li><li> Antes da experiência, em primeiro lugar adquirir a frequência e a dissipação do chip do sensor no ar, a fim de garantir uma montagem correcta. <ol><li> Para que o instrumento Q-Sense E1 ou E4 QCM-D comercial, execute o programa de software Q-Soft e clique em &quot;Aquisição&quot; e selecione &quot;Medição Setup&quot;. </li><li> Na nova janela que aparece, verifique a 3, 5, 7, 9, 11 e 13 tons e, em seguida, clique em Localizar e executar, a fim de verificar o espectro de ressonância. Definir a temperatura a 24 ° C. Se uma ou mais freqüências de ressonância não concordar com os valores esperados, verificar o chip de montagem e re-executar esta etapa até que seja alcançado um acordo. </li></ol></li><li> Comece a bomba peristáltica e o fluxo da solução tampão (10 mM Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,5) para a câmara de medição a uma taxa de fluxo de 100 mL / min. </li><li> No programa de software, clique em &quot;Aquisição&quot; e selecione &quot;Restart Medição&quot;, a fim de gravar os sinais de dissipação de frequência de ressonância e de energia. Repita este passo até uma linha de base estável é obtido para os deslocamentos de frequência e de dissipação. Nota: Para ver as etapas a seguir, haverá deslocamentos de frequência e de dissipação adicional que pode ser registada como uma função do tempo. </li><li> Injectar isopropanol (sem lípido) durante 10 min. </li><li> Injectar a mistura de lípido DOPC / colesterol norazão molar desejada, com uma concentração de lípido total de 0,5 mg / ml em isopropanol, durante 10 min. </li><li> Injectar tampão durante 20 min a um caudal de 100 ul / min. </li><li> Injectar uma solução de 1 mM de metil-β-ciclodextrina (MβCD) preparado em tampão (caudal 100 l / min) até que o sinal de frequência atinge um valor estável. </li><li> Medir as mudanças de freqüência positivos relativos que é causada pela etapa de tratamento MβCD e calcular a massa de colesterol e DOPC lipídios, convertendo os valores Af cho e Af DOPC para valores de massa, usando a equação de Sauerbrey [Dm = - (C / n) × Af, em que C = 17,7 ng / cm 2, N: Bifónico]. </li><li> Calcula-se a fracção molar de colesterol no SLB, tendo em conta os pesos moleculares de lípido DOPC (786,1 g / mol) e colesterol (386,6 g / mol). </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

Neste trabalho, um protocolo de solvente de permuta é apresentado na qual lípidos em álcool (isopropanol, etanol, ou n-propanol) são incubadas com um suporte sólido e, em seguida, o álcool é gradualmente substituído com uma solução tampão aquosa, a fim de conduzir uma série de transições de fase, eventualmente, produzir-fase lamelar bicamadas lipídicas 24. Mostra-se que o método permite a fabricação de bicamadas lipídicas apoiadas em superfícies tais como o ouro, que é insolúvel ao método de fusão de vesículas. Um intervalo de concentração de lípidos optimizada (0,1 - 0,5 mg / ml) foi determinada para a completa formação de bicamada, em formatos padrão experimentais testadas até agora. Com concentrações de lípidos abaixo de 0,1 mg / ml, discretas, manchas microscópicas de bicamadas formado. Por outro lado, a concentrações superiores a 0,1 mg / ml e inferior a 0,5 mg / ml, uma bicamada completa e uniforme. Em concentrações de lipídios acima deste intervalo, uma bicamada fluido ainda foi formada como verified por análise de FRAP, no entanto, a microscopia de fluorescência revela a presença de estruturas de lípidos adicionais no topo da camada dupla. Surpreendentemente, a morfologia destas estruturas de lípidos adicionais, tal como determinado por análise QCM-D, dependia do álcool que foi usado durante o passo de incubação. No caso de etanol, os deslocamentos relativamente elevadas de f e Δ D ô assemelhar-se a assinatura QCM-D obtida por uma camada adsorvida vesícula. Quando o isopropanol ou n-propanol em vez foi usado, o Δ f era ligeiramente mais elevado do que o valor esperado para uma bicamada (f Δ final entre -30 a -40 Hz), enquanto a Δ D foi significativamente superior. Tais respostas QCM-D seria esperado para as estruturas lipidicas prolongados (por exemplo, micelas vermiformes) salientes para fora a partir da superfície da membrana (como visível por microscopia de fluorescência, em alguns casos). A taxa de troca de solvente é um outro parâmetro importante que pode ser crítico, especially quando as concentrações de lípidos mais baixas (por exemplo, 0,1 mg / ml) são usadas. Rápida troca de solvente a baixa concentração de lípidos pode levar à formação de bicamadas incompletos. Na câmara de medição padrão usada para medições QCM-D neste papel (Q-Sense E4 câmara de medição), as taxas de fluxo de cerca de 100 mL / min, foram adequados para a formação de bicamada completa altamente reprodutível. Para as células de fluxo com outras geometrias e volume, a taxa de fluxo ideal pode variar e deve ser determinada empiricamente com base nos passos aqui sugeridas. Além de formar bicamadas lipídicas apoiadas em superfícies que são intratáveis ​​a fusão de vesículas, o SALB pode ser utilizado para contornar a necessidade de vesículas lipídicas que podem romper, abrindo assim as portas para a fabricação de membranas suportadas com composições complexas. Como exemplo ilustrativo de uma composição, misturas de lípidos com uma fracção elevada de colesterol foram examinados. O colesterol é um componente importante de mammAliã membranas celulares, e a sua fracção pode aproximar-se de 45-50% em moles de a composição lipídica da membrana (por exemplo, em eritrócitos). Assim, mesmo um modelo simples de uma bicamada lipídica representando uma membrana celular humana deve incluir colesterol. Embora a fusão da vesícula pode ser utilizado para fabricar bicamadas lipídicas fluídicos contendo apenas 10-15% de colesterol, o método permite a formação de SALB bicamadas lipídicas fluídicos fracções contendo altos de colesterol (até 57% em mol, tal como quantificado por medições QCM-D) 36. No entanto, quando o nível do colesterol foi ainda mais elevada (até 63% em mol), domínios em forma de faixa 37 foram observados. Os domínios de co-existentes eram líquidas, reminiscente do que as observadas na região de β no diagrama de fases da monocamada de fosfolípidos de colesterol / na interface ar-água. Em geral, o método de SALB é mostrado ser um método simples e eficiente para formar bicamadas lipídicas suportados, especialmente in casos que ultrapassam o âmbito do método de fusão das vesículas convencionais. Até agora, as técnicas de microscopia de fluorescência e QCM-D foram utilizados principalmente para caracterizar as bicamadas lipídicas formadas suportados pelo método SALB. Olhando para a frente, uma ampla gama de técnicas de medições analíticas sensíveis de superfície, incluindo ressonância de plasma de superfície (SPR) 38, microscopia de força atômica (AFM) 39,40, com transformada de Fourier espectroscopia de infravermelho 41, raio-X 42 e 43 nêutrons refletividade pode, ser utilizado para caracterizar adicionalmente e estudar configurações de bicamada simples e complexos Preparar pelo método SALB. Estas capacidades emergentes abrir a porta a um maior número de cientistas que podem explorar as membranas celulares artificiais, tirando partido de um protocolo experimental simples e robusto.

O sólido suportado bicamada lipídica 1 (SLB) é uma plataforma versátil que preserva as características básicas das biomembranas tais como a espessura da bicamada, difusividade lípido bidimensional, e a capacidade de acolher biomoléculas associadas a membranas. Devido à complexidade das membranas celulares naturais, esta plataforma simples tem sido demonstrado funcionar como uma plataforma eficiente para estudos in vitro de processos relacionados com a membrana, tais como formação de jangada 2, proteína de ligação 3, vírus e ligação partícula semelhante a vírus 4,5 e sinalização de 6 células. Formou-se em estreita proximidade com um suporte sólido, a plataforma SLB é compatível com uma gama de medições de superfície sensível técnicas tais como microscopia de reflexão interna total (TIRF), microbalança de cristal de quartzo de dissipação (QCM-D), e espectroscopia de impedância. Vários métodos têm sido desenvolvidos para produzir diferentes tipos de SLBS bolha de ar, incluindocolapso 7 e dip-pen nanolithography 8 para pontos de lipídios tamanho submicrométricas-, 9 para pilhas bicamada e Langmuir-Blodgett (LB) de 10 e fusão de vesícula (VF) 11 para full-spanning, revestimentos bicamada lipídica individuais de revestimento de spin. O método consiste em FV a adsorção de pequenas vesículas unilamelares a um suporte sólido e subsequente ruptura espontânea e fusão para formar uma bicamada lipídica contínua. No entanto, sob condições fisiológicas, rotura espontânea de vesículas é principalmente limitada a materiais à base de silício, tais como o dióxido de silício, vidro, e mica. Além disso, a ruptura de vesículas não ocorre espontaneamente em vesículas de composições de lípidos complexos, tais como aqueles contendo elevadas fracções de colesterol ou lípidos carregados negativamente. Dependendo do sistema, a ruptura da vesícula pode ser induzida através da adaptação ainda mais as condições experimentais, tais como a temperatura de 12, o pH da solução de 13, 14 e salinidade, choque osmótico 15 </saté&gt; 16 ou a pressão, ou a adição de iões divalentes, tais como Ca 2+ 17. Alternativamente, o péptido HA-activo da membrana pode ser introduzido, de modo a desestabilizar uma camada de vesículas adsorvidas, levando a ruptura das vesículas e formação de bicamada numa gama de superfícies 18-22. Além disso, a formação de bicamada bem sucedida requer uma preparação de uma população bem controlada de pequenas vesículas unilamelares, que pode ser demorado e difícil de conseguir para certas composições de membrana. Portanto, apesar da sua elevada eficiência, em casos ideais (por exemplo, depois de extensa pré-tratamento de congelamento-descongelamento de vesículas 23), a aplicação geral de fusão das vesículas está limitado pelo âmbito de substratos adequados e composições de membrana. O método assistido por solvente 24-28 bicamada lipídica (SALB) é uma técnica de fabricação alternativo que não requer vesículas lipídicas. O método baseia-se na deposição óf moléculas lipídicas sobre uma superfície sólida, na presença de um solvente orgânico miscível com água, seguido por troca gradual de este solvente com uma solução tampão aquosa, a fim de provocar a formação de SLB. Durante o passo de permuta de solvente, a mistura ternária de lípidos, solvente orgânico, e a água passa por uma série de transições de fase com o aumento da fracção de água, o que leva à formação de estruturas de fase lamelar em solução em massa e um SLB no substrato sólido. Importante, este trajecto de auto-montagem evita a necessidade de ruptura de vesículas, que geralmente é o passo limitante para a transformação de vesículas adsorvidos num SLB. O protocolo é aplicável a uma ampla variedade de superfícies, incluindo o dióxido de silício, óxido de alumínio, de cromo, óxido de índio e estanho e ouro. Neste papel e no vídeo acompanhante, uma comparação de deposição de lípidos pela SALB e métodos de fusão de vesículas é apresentado. Em particular, a influência dos parâmetros experimentais, incluindo a concentração de lípido, A taxa de fluxo, e a escolha de água solvente orgânico miscível, sobre a qualidade da bicamada formado pelo método SALB são discutidos. A caracterização analítica dos SLBS fabricados é realizada pela QCM-D, microscopia de fluorescência, e recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) técnicas. Monitorização QCM-D é uma técnica de medição de massa sensíveis à superfície que, uma vez que o trabalho pioneiro conduzido por Keller e Kasemo 29, tem sido amplamente utilizada para investigar quantitativamente formação em bicamada. A microscopia de fluorescência permite a inspecção de homogeneidade da membrana, bem como a visualização de domínios de membrana. A técnica FRAP é uma ferramenta padrão para determinar a mobilidade lateral das moléculas de lípidos em uma SLB, que é uma propriedade essencial das membranas fluídicos. A primeira parte deste estudo envolve a análise QCM-D do SALB e métodos de fusão de vesículas aplicada para tentar a formação de bicamada em dióxido de silício e ouro. Na segunda parte,a preparação e caracterização das membranas de suporte contendo uma gama de concentrações de colesterol com o método SALB são demonstradas e os resultados são comparados com os obtidos pelo método de fusão das vesículas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1459">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QCM-D gold-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Sense E4 module</td>
			<td>QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plasma Cleaner, PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-001 (115V)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:217px;">700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:217px;">C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">673773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">n-propanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">279544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sticky-Slide I 0.1 Luer</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">81128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Male elbow 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:356px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:217px;">30505-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Silicon tubing 1.6mm ID</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:356px;">Ismatec</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">71725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

A fim de imitar as membranas celulares, a bicamada lipídica suportado (SLB) é uma plataforma que permite atraente na investigação de processos in vitro relacionadas com a membrana, enquanto que confere biocompatibilidade e biofuncionalidade a substratos sólidos. A adsorção e ruptura espontânea de vesículas fosfolipídicas é o método mais comummente utilizado para formar SLBS. No entanto, sob condições fisiológicas, a fusão das vesículas (VF) é limitado a apenas um subconjunto das composições de lipidos e suportes sólidos. Aqui, nós descrevemos um procedimento geral de um chamado passo do método de formação assistida por solvente bicamada lipídica (SALB), a fim de formar SLBS que não necessita de vesículas. O método envolve SALB a deposição de moléculas de lípidos sobre uma superfície sólida, na presença de solventes orgânicos miscíveis em água (por exemplo, isopropanol) e subsequente troca de solvente com uma solução aquosa de tampão, a fim de provocar a formação de SLB. O passo de troca de solvente contínua permite a aplicação dométodo em uma configuração de fluxo adequado para a formação de bicamada monitorização e alterações subsequentes que utilizam uma vasta gama de biossensores sensíveis à superfície. O método SALB pode ser usado para fabricar SLBS sobre uma vasta gama de superfícies sólidas hidrofílicos, incluindo aqueles que são intratáveis ​​a fusão das vesículas. Além disso, permite a fabricação de compostos SLBS de composições de lípidos que não pode ser preparado utilizando o método de fusão das vesículas. Nisto, nós comparar os resultados obtidos com os métodos de fusão de vesícula SALB e convencionais em duas superfícies hidrofílicas ilustrativos, dióxido de silício e ouro. Para optimizar as condições experimentais para a preparação das bicamadas de alta qualidade preparados através do método de SALB, o efeito de vários parâmetros, incluindo o tipo de solvente orgânico no passo de deposição, a taxa de permuta de solvente, e a concentração de lípido é discutido juntamente com dicas de resolução de problemas . Formação de membranas apoiadas contendo altas frações de colesterol é também demôniostrados com o método SALB, destacando as capacidades técnicas da técnica SALB para uma ampla gama de configurações de membrana.

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Apresenta-se um protocolo experimental para formar uma bicamada lipídica suportado sobre substratos sem a utilização de vesículas lipídicas. Nós demonstramos um método de um só passo para formar uma bicamada lipídica em dióxido de silício e ouro, bem como membranas suportadas com o domínio enriquecida em colesterol durante várias aplicações biológicas.

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