Name: biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00
Duration: 9 min 38 s
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Los autores desean agradecer el apoyo de la Fundación Nacional de Investigación (NRF -NRFF2011-01 y NRF2015NRF-POC0001-19), el Consejo Nacional de Investigación Médica (NMRC / CBRG / 0005/2012), y la Universidad Tecnológica de Nanyang a NJC

1. Formación de admitidos bicapa lipídica sobre un soporte sólido hidrófilo <ol><li> Preparar soluciones de lípidos del stock de 10 mg / ml de 1,2-sn -glicero dioleoyl--3-fosfocolina (DOPC) y 1 mg / ml de 1,2-sn -glicero dioleoyl--3-phosphoethanolamine- N - (lisamina rodamina B sulfonil) (Rh-PE) por disolución de los polvos respectivos lípidos (apropiadamente pesó de antemano con una balance de masa analítica) en una solución de isopropanol. </li><li> Diluir y mezclar las soluciones madre en isopropanol a fin de preparar la mezcla de lípidos deseada a la concentración final. Para la microscopía de fluorescencia y FRAP experimentos, 0,5% en peso de Rh-PE debería incluirse en la mezcla de lípidos. </li><li> Inyectar la mezcla de lípidos en isopropanol en el canal microfluídico hasta que se llena. </li><li> Incubar la mezcla de lípidos en la superficie de vidrio durante aproximadamente 10 min. </li><li> Poco a poco reemplazar la solución de lípidos con una solución de agua o tampón usando una bomba peristáltica a un caudal muy bajo(10-50 l / min). Alternativamente, reemplace la mezcla de lípidos mediante pipeteo repetido. </li><li> Enjuague el canal a fondo con el exceso de tampón con el fin de eliminar el isopropanol residual. </li></ol> 2. La formación de membranas soportadas colesterol enriquecido Nota: La superficie sólida (SiO2) apoya la fusión de vesículas, pero la composición de la membrana (colesterol alto) inhibe la fusión de vesículas porque vesículas de colesterol enriquecido han doblado alta rigidez 30. <ol><li> Preparar una solución madre que contiene 10 mg / ml de lípidos DOPC, 10 mg / ml de colesterol, y 1 mg / ml Rh-PE disolviendo primero los polvos respectivos en isopropanol. </li><li> Repita los pasos 1,2 a 1,6 usando las soluciones madre preparadas en el paso 2.1. </li></ol> 3. Membrana Fluidez Ensayo <ol><li> Sumergir el portaobjetos de vidrio en solución de sodio dodecil sulfato (SDS) (1%) durante 10 min. </li><li> Se lavan los portas bien con agua desionizada y enjuague ingenioh etanol. </li><li> Blow-seca diapositivas utilizando una corriente suave de nitrógeno. </li><li> Exponer los portaobjetos a plasma de oxígeno durante 30 segundos a la máxima potencia de radiofrecuencia en la cámara de plasma de oxígeno. </li><li> Retire el revestimiento de película protectora del fondo comercial cámara de microfluidos (Figura 1A), utilizando una pinza y coloque la placa de vidrio sobre la cara adhesiva de la cámara (Figura 1B). </li><li> Montar los conectores y tubos en las posiciones de entrada y de salida de la cámara y coloque el canal microfluídico en la platina del microscopio (Figura 1C). </li><li> Formar una bicapa lipídica marcado fluorescentemente apoyado en el canal microfluídico [repita el paso 1 usando la composición lipídica deseado (por ejemplo, 0,5 mg / ml DOPC), incluyendo 0,5% en peso de Rh-PE en un disolvente orgánico]. </li><li> Localice el plano bicapa con un objetivo de inmersión en aceite de 60X (NA 1.49) con el fin de capturar imágenes. </li><li> Tome dos imágenes antes de la lejía, a continuación, la foto-Bleach 301; m mancha circular de ancho, con un haz de láser 532 mW nm, 100. Antes de photobleaching, calentar el láser hasta que su intensidad se ha convertido estable. Inmediatamente después de photobleaching, capturar una serie de imágenes cada 1 s durante 2 min con el fin de seguir la recuperación de la intensidad de fluorescencia en el lugar blanqueada. </li></ol> Ensayo Cuantificación 4. Colesterol <ol><li> Exponer el chip sensor revestido de cristal de cuarzo-dióxido de silicio a plasma de oxígeno durante 30 segundos a la máxima potencia de radiofrecuencia en la cámara de plasma de oxígeno. Retirar el chip de la cámara y de inmediato montar el chip en la cámara de medición. </li><li> Antes de experimento, primero adquirir la frecuencia y la disipación del chip sensor en el aire con el fin de asegurar el montaje correcto. <ol><li> Para el instrumento Q-Sense E1 o E4 QCM-D comercial, ejecute el programa de software Q-Soft y haga clic en &quot;Adquisición&quot; y seleccione &quot;Medición de configuración&quot;. </li><li> En la nueva ventana que aparece, marque el 3, 5, 7, 9, 11 y 13 matices y luego haga clic en Buscar y Ejecutar el fin de comprobar los espectros de resonancia. Ajuste la temperatura a 24 DO. Si una o más frecuencias de resonancia no están de acuerdo con los valores esperados, revise el chip de montaje y vuelva a realizar este paso hasta que se alcance un acuerdo. </li></ol></li><li> Arrancar la bomba peristáltica y el flujo de solución tampón (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) en la cámara de medición a una velocidad de flujo de 100 l / min. </li><li> En el programa de software, haga clic en &quot;Adquisición&quot; y seleccione &quot;Medición Reiniciar&quot; para registrar las señales de disipación de frecuencia de resonancia y la energía. Repita este paso hasta que se obtiene una línea de base estable para los desplazamientos de frecuencia y la disipación. Nota: Para ver los pasos de aquí en adelante, no habrá cambios de frecuencia y de disipación adicionales que se pueden grabar en función del tiempo. </li><li> Inyectar isopropanol (sin lípido) durante 10 min. </li><li> Se inyecta la mezcla de lípidos DOPC / colesterol en larelación molar deseada con una concentración lipídica total de 0,5 mg / ml en isopropanol durante 10 min. </li><li> Inyectar tampón durante 20 min a un caudal de 100 l / min. </li><li> Inyectar una solución de 1 mM metil-β-ciclodextrina (MβCD) preparado en tampón (caudal 100 l / min) hasta que la señal de frecuencia alcanza un valor estable. </li><li> Medir los desplazamientos de frecuencia positivos relativos que es causada por la etapa de tratamiento MβCD y calcular la masa de colesterol y DOPC lípidos mediante la conversión de los valores? F cho y Df DOPC a los valores de masa mediante el uso de la ecuación de Sauerbrey [Delta M = - (C / N) x ? f, donde C = 17,7 ng / cm 2, n: sobretono]. </li><li> Calcular la fracción molar de colesterol en el SLB, teniendo en cuenta los pesos moleculares de los lípidos DOPC (786,1 g / mol) y colesterol (386,6 g / mol). </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

En este trabajo, un protocolo de intercambio de disolvente se presenta en el cual los lípidos en alcohol (isopropanol, etanol o n-propanol) se incuban con un soporte sólido y luego el alcohol se sustituye gradualmente con una solución tampón acuosa con el fin de conducir una serie de transiciones de fase con el tiempo producir bicapas lipídicas laminares de fase 24. Se muestra que el método permite la fabricación de bicapas lipídicas soportadas en superficies tales como oro, que es intratable con el método de la fusión de vesículas. Un intervalo de concentración de lípidos óptima (0,1 - 0.5 mg / ml) se ha determinado para la formación de bicapa completa en formatos estándar experimentales ensayadas hasta el momento. A concentraciones de lípidos por debajo de 0,1 mg / ml, discretos parches, microscópicas de bicapas formado. Por otra parte, a concentraciones superiores a 0,1 mg / ml y menor que 0,5 mg / ml, se forma una bicapa completa y uniforme. A concentraciones de lípidos por encima de este rango, una bicapa fluida todavía estaba formada como verified por análisis FRAP, sin embargo, la microscopía de fluorescencia revela la presencia de estructuras de lípidos adicionales en la parte superior de la bicapa. Sorprendentemente, la morfología de estas estructuras de lípidos adicionales, tal como se determina por análisis de QCM-D, dependía del alcohol que se usó durante la etapa de incubación. En el caso del etanol, las relativamente altas turnos F y Δ D delta se asemejan a la firma QCM-D obtenido para una capa de vesículas adsorbido. Cuando se utilizó en lugar isopropanol o n-propanol, el Δ f fue ligeramente mayor que el valor esperado para una bicapa (Δ f final entre -30 a -40 Hz), mientras que el Δ D era apreciablemente mayor. Tales respuestas QCM-D se espera para las estructuras de lípidos prolongados (por ejemplo, micelas similares a gusanos) que sobresalen hacia fuera desde la superficie de la membrana (tan visibles por microscopía de fluorescencia en algunos casos). La tasa de cambio de disolvente es otro parámetro importante que puede ser crítico, especially cuando se utilizan concentraciones de lípidos inferiores (por ejemplo, 0,1 mg / ml). Cambio rápido disolvente a baja concentración de lípidos puede conducir a la formación de bicapas incompletos. En la cámara de medida estándar utilizada para mediciones QCM-D en este trabajo (cámara de medición Q-Sense E4), las tasas de flujo de alrededor de 100 l / min, eran adecuados para la formación de bicapa completa altamente reproducible. Para las células de flujo con otras geometrías y el volumen, la velocidad de flujo óptima puede variar y debe ser determinada empíricamente basado en los pasos sugeridos en el presente documento. Además de formar bicapas lipídicas soportadas en superficies que son intratables a la fusión de vesículas, la SALB se puede emplear para eludir la necesidad de vesículas lipídicas que puede romperse, abriendo así la puerta a la fabricación de membranas apoyadas con composiciones complejas. Como un ejemplo ilustrativo composición, se examinaron mezclas de lípidos con una alta fracción de colesterol. El colesterol es un componente importante de mammalian las membranas celulares, y su fracción de 45-50 pueden acercarse mol% de la composición lipídica de la membrana (por ejemplo, en los eritrocitos). Por lo tanto, incluso un modelo simple de una bicapa lipídica que representa una membrana de célula humana debe incluir colesterol. Mientras que la fusión de vesículas podría ser utilizado para fabricar las bicapas lipídicas de fluidos que contienen sólo el 10-15% de colesterol, el método permite SALB formación de bicapas lipídicas de fluidos que contienen altas fracciones de colesterol (hasta 57% en moles, tal como se cuantifica por medio de mediciones QCM-D) 36. Sin embargo, cuando el nivel de colesterol se elevó aún más (hasta 63% en moles), se observaron los dominios de la raya con forma 37. Los dominios coexistentes eran líquidas, que recuerda a los observados en la región β en el diagrama de fases de la monocapa de colesterol / fosfolípidos en la interfase aire-agua. En general, el método SALB se demuestra que es un enfoque simple y eficiente para formar bicapas lipídicas soportadas, especialmente in casos más allá del alcance del método de la fusión de vesículas convencionales. Hasta ahora, la técnica y la microscopía de fluorescencia QCM-D se utilizan principalmente para caracterizar las bicapas lipídicas apoyados formados por el método SALB. Mirando hacia adelante, una amplia gama de mediciones analíticas técnicas sensibles de superficie, incluyendo resonancia de plasmón superficial (SPR) 38, microscopía de fuerza atómica (AFM) 39,40, transformada de Fourier espectroscopia infrarroja 41, de rayos X 42 y la reflectividad de neutrones 43 puede, ser utilizado para caracterizar y estudiar configuraciones bicapa simples y complejas preparan por el método SALB. Estas capacidades emergentes abren la puerta a un mayor número de científicos que pueden explorar las membranas celulares artificiales mediante el aprovechamiento de un protocolo experimental sencillo y robusto.

El soporte sólido bicapa lipídica 1 (SLB) es una plataforma versátil que conserva las características básicas de las biomembranas tales como el espesor de bicapa, difusividad de los lípidos de dos dimensiones, y la capacidad de alojar biomoléculas asociadas a la membrana. Debido a la complejidad de las membranas celulares naturales, esta plataforma sencilla se ha demostrado que funcionan como una plataforma eficiente para los estudios in vitro de los procesos relacionados con la membrana como la formación de balsa 2, proteína de unión 3, virus y vinculante partícula de virus-like 4,5 y señalización celular 6. Formado en las proximidades de un soporte sólido, la plataforma SLB es compatible con una amplia gama de técnicas de mediciones sensibles de superficie tales como microscopía de reflexión interna total de (TIRF), microbalanza de cristal de cuarzo de disipación (QCM-D), y la espectroscopia de impedancia. Varios métodos han sido desarrollados para producir diferentes tipos de SLBS, incluyendo burbuja de airecolapso 7 y dip-pen nanolitografía 8 para las manchas de lípidos de tamaño submicrónico, spin-coating 9 para pilas bicapa y Langmuir-Blodgett (LB) 10 y la fusión de vesículas (VF) 11 para-que abarca por completo, recubrimientos individuales bicapa lipídica. El método VF consiste en la adsorción de pequeñas vesículas unilamelares a un soporte sólido y ruptura espontánea posterior y la fusión para formar una bicapa lipídica continua. Sin embargo, bajo condiciones fisiológicas, la rotura espontánea de vesículas se limita principalmente a los materiales basados ​​en silicio, tales como dióxido de silicio, vidrio y mica. Además, la rotura de la vesícula no se produce de forma espontánea para vesículas de lípidos complejos de composiciones tales como los que contienen altas fracciones de colesterol o lípidos cargados negativamente. Dependiendo del sistema, la ruptura de la vesícula puede ser inducida por la adaptación aún más las condiciones experimentales tales como la temperatura 12, la solución de pH 13, 14 y la salinidad, choque osmótico 15 </sup&gt; o presión 16, o la adición de iones divalentes tales como Ca 2 + 17. Alternativamente, el péptido AH-membrana activa se puede introducir con el fin de desestabilizar una capa de vesículas adsorbidos, lo que lleva a la ruptura de la vesícula y la formación de bicapa en una gama de superficies 18-22. Por otra parte, la formación de bicapa exitosa requiere la preparación de una población bien controlada de pequeñas vesículas unilamelares que puede llevar mucho tiempo y difícil de lograr para ciertas composiciones de membrana. Por lo tanto, a pesar de su alta eficiencia en casos óptimos (por ejemplo, después de una extensa pretratamiento de congelación-descongelación de vesículas 23), la aplicación general de la fusión de vesículas está limitada por el alcance de sustratos adecuados y composiciones de membrana. El método disolvente asistida bicapa lipídica (SALB) 24-28 de es una técnica de fabricación alternativa que no requiere vesículas lipídicas. El método se basa en la deposición of moléculas de lípidos sobre una superficie sólida en presencia de un disolvente orgánico miscible en agua, seguido por intercambio gradual de este disolvente con una solución tampón acuosa con el fin de desencadenar la formación SLB. Durante la etapa de intercambio de disolvente, la mezcla ternaria de lípidos, disolvente orgánico, y el agua se somete a una serie de transiciones de fase con el aumento de la fracción de agua, que conduce a la formación de estructuras de fase lamelar en la solución a granel y un SLB en el sustrato sólido. Es importante destacar que esta ruta auto-ensamblaje evita la necesidad de ruptura de la vesícula, que suele ser la etapa limitante para la transformación de vesículas adsorbidos en un SLB. El protocolo es aplicable a una amplia variedad de superficies, incluyendo dióxido de silicio, óxido de aluminio, cromo, óxido de indio y estaño, y oro. En este documento y en el vídeo que acompaña, se presenta una comparación de la deposición de lípidos por el SALB y métodos de fusión de vesículas. En particular, la concentración de lípidos de la influencia de los parámetros experimentales, incluyendo, Se discuten velocidad de flujo, y la elección de disolvente orgánico miscible agua, en la calidad de la bicapa formada por el método SALB. Caracterización analítica de los SLBS fabricadas se lleva a cabo por el QCM-D, microscopía de fluorescencia, y la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP) técnicas. Monitoreo QCM-D es una técnica de medición sensible a la masa de la superficie que, desde el trabajo pionero conducido por Keller y Kasemo 29, se ha utilizado ampliamente para investigar cuantitativamente formación de bicapa. Microscopía de fluorescencia permite la inspección de la homogeneidad de la membrana, así como la visualización de los dominios de membrana. La técnica FRAP es una herramienta estándar para determinar la movilidad lateral de moléculas de lípidos en un SLB, que es una propiedad esencial de las membranas de fluidos. La primera parte de este estudio implica el análisis QCM-D de la SALB y métodos de fusión de vesículas aplicado para intentar formación de bicapa en dióxido de silicio y el oro. En la segunda parte,la preparación y caracterización de las membranas soportado que contiene un rango de concentraciones de colesterol con el método SALB se demuestran y los resultados se compararon con los obtenidos por el método de la fusión de vesículas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1459">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QCM-D gold-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Sense E4 module</td>
			<td>QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plasma Cleaner, PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-001 (115V)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:217px;">700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:217px;">C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">673773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">n-propanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">279544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sticky-Slide I 0.1 Luer</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">81128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Male elbow 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:356px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:217px;">30505-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Silicon tubing 1.6mm ID</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:356px;">Ismatec</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">71725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

Con el fin de imitar las membranas celulares, la bicapa lipídica apoyado (SLB) es una plataforma atractiva que permite en la investigación in vitro de los procesos relacionados con la membrana, mientras que confiere biocompatibilidad y biofuncionalidad a sustratos sólidos. La adsorción espontánea y la ruptura de las vesículas de fosfolípidos es el método más comúnmente utilizado para formar SLBS. Sin embargo, bajo condiciones fisiológicas, la fusión de vesículas (VF) se limita a sólo un subconjunto de composiciones lipídicas y soportes sólidos. Aquí se describe un procedimiento general de un solo paso llamado el método de formación de disolvente con ayuda de bicapa lipídica (SALB) con el fin de formar SLBS que no requiere vesículas. El método SALB implica la deposición de moléculas de lípidos sobre una superficie sólida en presencia de disolventes orgánicos miscibles en agua (por ejemplo, isopropanol) y de intercambio de disolvente posterior con solución tampón acuosa con el fin de desencadenar la formación SLB. La etapa de intercambio de disolvente continuo permite la aplicación de lamétodo en una configuración de flujo pasante adecuada para la formación de monitoreo bicapa y subsiguientes alteraciones utilizando una amplia gama de biosensores sensibles a la superficie. El método SALB se puede utilizar para fabricar SLBS en una amplia gama de superficies sólidas hidrófilas, incluyendo aquellos que son intratables a la fusión de vesículas. Además, permite la fabricación de SLBS compuestas de composiciones lipídicas que no se pueden preparar utilizando el método de la fusión de vesículas. En este documento, se comparan los resultados obtenidos con los métodos de fusión de vesículas SALB y convencionales sobre dos superficies hidrófilas ilustrativos, dióxido de silicio y el oro. Para optimizar las condiciones experimentales para la preparación de bicapas de alta calidad preparadas a través del método SALB, el efecto de varios parámetros, incluyendo el tipo de disolvente orgánico en la etapa de deposición, la tasa de intercambio de disolvente, y la concentración de lípidos se discute junto con sugerencias para solucionar problemas . Formación de apoyo a las membranas que contienen altas fracciones de colesterol es también demoniostrado con el método SALB, destacando las capacidades técnicas de la técnica SALB para una amplia gama de configuraciones de membrana.

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Se presenta un protocolo experimental para formar una bicapa lipídica apoyado sobre soportes sólidos sin usar vesículas lipídicas. Se demuestra un método de un solo paso para formar una bicapa lipídica en dióxido de silicio y oro, así como membranas soportadas con dominio enriquecida en colesterol para diversas aplicaciones biológicas.

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