Name: 3d hydrogel scaffolds for articular chondrocyte culture and cartilage generation
Uploaded: 2015-10-07T14:00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Stanford Department of Orthopaedic Surgery and Stanford Coulter Translational Seed Grant for funding. J.H.L. would like to thank National Science Foundation Graduate Fellowship and DARE Doctoral Fellowship for support.

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Stanford University Human proefpersonen en Institutional Review Board protocol goedgekeurd. 1. Articulaire Chondrocyte Isolatie <ol><li> Verkrijgen kraakbeen weefsel tijdens de totale knieprothese weggegooid en ontleden zoals eerder 8 beschreven. </li><li> Selecteer visueel het mediale of laterale femurcondylen kraakbeen monsters voor gladde oppervlakken en maak snede in het oppervlak van het kraakbeen door een scalpel om 4-5 mm kraakbeen biopsieën verwijderen zonder dat de subchondrale bot. </li><li> Isoleer chondrocyten van de extracellulaire matrix door enzymatische dissociatie van het weefsel met O / N behandeling met gezuiverd collagenase. Met 1: 1 verhouding van collagenase II (125 U / ml) en collagenase IV (160 U / ml) in chondrocyten groei media bij 37 ° C. </li><li> De volgende dag, filteren het gedigereerde weefsel dat de gedissocieerde cellen door een 70mm poriegrootte Nylon mesh. Was tweemaal met 20 ml DMEM / F12 en centrifugeer bij 600 g gedurende 5 min. </li><li> Plaat de geïsoleerde chondrocyten met een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / 60 mm kweekschaal na resuspensie in DMEM / F12 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 25 ug / ml ascorbaat, 2 mM L-glutamine, antibiotica (100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 0,25 ug / ml fungizon). Laat de platen bij 37 ° C en de primaire chondrocyten kweken als een high-density monolaag houden vóór inkapseling in biomimetische hydrogels. </li></ol> 2. Biomimetic Hydrogel Fabrication Opmerking: deze methode kan de synthese van een biomimetische hydrogel bevattende poly (ethyleen glycol diacrylaat) (PEGDA, MW 5000 g / mol), chondroïtinesulfaat-methacrylaat (CS-MA) in DPBS. De toevoeging van foto-initiator maakt licht geactiveerde verknoping. De uiteindelijke hydrogelsamenstelling bevat 7% wegent / volume (w / v) van PEGDA, 3% w / v van CS-MA en 0,05% w / v van fotoinitiator. <ol><li> Synthetiseren CS-MA door functionaliseren CS polymeer met methacrylaatgroepen. <ol><li> Bereid gebufferde oplossing van 50 mM 2-morfolinoethaansulfonzuur (MES) en 0,5 M natriumchloride (NaCl) door het oplossen van 1,952 g MES en 5,84 g NaCl in 200 ml gedeïoniseerd water (DIH 2 O). Los in de gebufferde oplossing 5 g chondroïtinesulfaat natriumzout. </li><li> Voeg 0,532 g (4,62 mmol) N-hydroxysuccinimide (NHS) en 1,771 g (9,24 mmol) 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) (molaire verhouding NHS: EDC = 1: 2) om de oplossing en roer gedurende 5 min. </li><li> Voeg 0,765 g (4,62 mmol) 2-aminoethyl methacrylaat (AEMA) (molaire verhouding NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) aan de oplossing en de reactie bij kamertemperatuur gedurende 24 uur te handhaven. </li><li> Zuiver het mengsel door dialyse tegen gedeïoniseerd water (DIH 2 O) gedurende 4 dagen via dialysebuizen (12-14 kDa MWCO). </li><li> Filter de purified oplossing door een 0,22 urn filter en plaats de open buizen met de oplossing in de exsiccator en vacuum O / N. Zorg ervoor dat alle buizen worden beschermd tegen het licht. Bewaar het opgelost polymeer bij -20 ° C beschermd tegen licht en vocht. </li></ol></li></ol> 3. Cell Encapsulation <ol><li> Autoclaaf de PCR-film en cilindrische staven (voor het ponsen van de cel-beladen 3D hydrogels) en steriliseer de op maat gemaakte cilindrische gel schimmel door onderdompeling in 0,2 urn gefilterde 70% ethanol in weefselkweek kap onder UV-licht. </li><li> Dicht de onderkant van de gel vorm met geautoclaveerd PCR film zonder luchtbellen of spleten om lekkage te voorkomen. Hou het in een steriele 150 mm plaat. </li><li> De dag voor celinkapselende in biomimetische hydrogel, dissociëren de high-density chondrocyten monolaag met O / N behandeling Collagenase II en IV Collagenase oplossing. Gebruik 125 U / ml voor Collagenase II en 160 U / ml collagenase VI voor elk in chondrocyten groeimediumbij 37 ° C. </li><li> Neem een ​​50 ml buis en voeg 5% gewicht / volume (w / v) poly (ethyleen glycol diacrylaat) (PEGDA, MW = 5000 g / mol), 3% w / v chondroïtinesulfaat-methacrylaat (CS-MA), en 0,05% w / v fotoinitiator in DPBS. Vortex de buis om de oplossing te mengen en apart houden. Bescherm de buis van licht. </li><li> Verzamel de gedissocieerde cellen in een 50 ml Falcon buis, tellen en centrifugeer bij 460 xg gedurende 5 min. Zuig alle media uit de cellen buis en voeg de bovenstaande gemengde gel materiaal resuspendeer cellen bij een dichtheid van 15 x 10 6 cellen / ml. Meng het 30 keer grondig terwijl het vermijden van de vorming van luchtbellen. </li><li> Pipetteer 72 ul van de cel-suspensie hydrogel of hydrogel alleen in de op maat gemaakte gel cilindrische vorm en gelering te induceren door middel van blootstelling aan UV-licht (365 nm golflengte) van 3 mW / m 2 gedurende 5 min. Bereid sommige hydrogel oplossing met geen mobiele content. Met deze constructen als negatieve controles voor de toekomstige biochemische en mechanische testen. Measuopnieuw de intensiteit van het UV licht met een UV intensiteit meter. Om de intensiteit aan te passen, wijzigt u de afstand tussen de UV-lichtbron en de hydrogel schavot tijdens geleren. OPMERKING: Omdat de hydrogel bevat CS, wordt de acellulaire bijdrage afgetrokken van de biochemische GAG ​​inhoud van de cel beladen hydrogels alleen de cellulaire GAG ​​vertegenwoordigen. </li><li> Gebruik een scalpel om de film voor een eenvoudige schil af te snijden en verwijder deze voorzichtig. Met de hulp van de cilindrische staven, duwen de gel in een 6-wells plaat met 5 ml steriel DPBS te wassen gepolymeriseerde gel en losse cellen. </li><li> De cultuur van de cel-beladen hydrogels in 24 well platen met 1,5 ml chondrocyten groei media in elk putje. Gebruik een wegwerp spatel om de gewassen hydrogels zetten in de put. </li><li> Beoordelen levensvatbaarheid van de cellen door levend dood kleuring 24 uur na inkapseling met een levensvatbaarheid / cytotoxity kit. De cultuur van de cel-beladen hydrogels en de lege hydrogels voor 3-6 weken veranderen frisse chondrocyten growth media om de 2 dagen voor de oogst voor de analyses. </li></ol> 4. RNA-extractie en genexpressie analyses <ol><li> Zorgvuldig aspireren de media en zet steriele 1X PBS aan de cellen beladen en de lege controle hydrogels. </li><li> Met behulp van een steriele spatel, breng elke hydrogel een schone 1,5 ml eppendorfbuisje en voeg 250 ul van Tri-reagens aan elke buis. Volg de instructies van de fabrikant om RNA te isoleren. </li><li> Na RNA isolatie en kwantificering gebruik 1 ug van het van elk monster en het uitvoeren van een omgekeerde transcriptie in cDNA met behulp van de High Capacity cDNA reverse transcriptie Kit. </li><li> Voor kwantitatieve PCR gebruiken TaqMan Gene Expression Arrays voor het onderzoek van de expressie van de genen van belang. Normaliseren van de genexpressie niveaus intern GAPDH. </li><li> Voor de PCR-omstandigheden omvatten een 2 minuten incubatie bij 50 ° C eerdere amplicons met uracil-DNA glycosylase inactiveren, gevolgd door een 1060; min incubatie bij 95 ° C om het Taq polymerase te activeren. Voer veertig PCR-cycli bestaande uit 15 sec bij 95 ° C en 1 min bij 60 ° C. </li></ol> 5. Biochemische Analyses <ol><li> Voor elke cel-hydrogel constructen kwantificeren DNA en gesulfateerd glycosaminoglycaan (sGAG) produceren als volgt. </li><li> Zorgvuldig aspireren de media en zet steriele 1X PBS aan de cellen beladen en de lege controle hydrogels. Weeg een lege tube en zet de hydrogel binnenkant na deppen het op zijdepapier en registreer het gewicht of natte gewicht van de hydrogels. </li><li> Bevries elk hydrogel bij -20 ° C in een afzonderlijke 1,5 ml eppendorfbuisje voor enzymatische digestie en later gebruik van een aliquot van het verteerde product Picogreen-test (DNA) en dimethyl-methyleenblauw assay (voor GAG) in werking. </li><li> Bereid de papainase oplossing enzymatische digestie van de hydrogels. <ol><li> Maak eerst de PBE buffer door weging uit 7,1 g natrium Phosphate dibasisch (Na 2 HPO 4) en 1,6 g ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout (EDTA-Na 2). Oplossen in 500 ml dH 2 O, de pH op 6,5 en filtreer de gezuiverde oplossing door een 0,22 mm filter. </li><li> Oplossen in 20 ml PBE buffer 0,035 g L-cysteïne. Filtreer de oplossing en 100 ui steriel enzym papaïne. </li></ol></li><li> Als direct de assays, neemt de buizen van -20 ° C en voeg 300 ul van het gereed papaïne oplossing van het bevroren hydrogels. Plet de gel met een vijzel en stamper en meng het goed met de motor stamper. </li><li> Breng het volume tot 500 ul met extra papaïne oplossing. Voer dezelfde procedure voor de controle gels. Incubeer bij 60 ° C gedurende 16 uur 3,9. De oplossing die het gedigereerde hydrogel kan daarom gebruikt voor DNA kwantificatie en GAG. De DNA-inhoud met de Picogreen test met Lambda faag DNA als standaard volgende pr fabrikant metenotocol. </li><li> Kwantificeren van de gesulfateerde GAG-inhoud met behulp van de 1,9-dimethylmethyleen blauw (DMMB) kleurstof bindingstest met haai chondroïtinesulfaat standaard 10. Bepaal het GAG gehalte in de hoeveelheid GAG delen voor de overeenkomstige natgewicht. </li></ol> 6. Mechanische Testen <ol><li> Voeren onbeperkte compressie testen met behulp van een Instron 5944 testsysteem uitgerust met een 10 N load cell. <ol><li> Nadat de gewenste dagen in vitro cultuur, voert u de compressie-test op de mobiele-hydrogel schavot en de acellulaire controle hydrogels. </li><li> Dompel de monsters in PBS bad bij kamertemperatuur en te comprimeren met een snelheid van 1% rek / sec tot een maximale rek van 15% 11,12 omdat de lichamelijke belasting ervaren door kraakbeenweefsel onder belastingstoestand is gerapporteerd 10-20% te zijn 13,14. </li></ol></li><li> Maak spanning vs. rek bochten en curve fit met behulp van een derde orde veeltermvergelijking. Bepaal de compressive tangent modulus van de kromme passende vergelijking ten rekwaarden van 15%. </li></ol>

<ol>
	<li>Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+study+of+collagen+types+I+and+II+and+procollagen+IIA+in+human+cartilage+repair+tissue+following+autologous+chondrocyte+implantation.">Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation.</a> Knee. 16, 398-404 (2009).</li><li>Smeriglio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Potential+of+Juvenile+and+Adult+Human+Articular+Chondrocytes+for+Cartilage+Tissue+Formation+in+Three-Dimensional+Biomimetic+Hydrogels.">Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Scientific reports. 3, 3553 (2013).</li><li>Taipale, J., Keski-Oja, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+in+the+extracellular+matrix.">Growth factors in the extracellular matrix.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).</li><li>Varghese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+based+niches+for+chondrogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).</li><li>Park, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+stiffness+on+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+response+to+TGF-beta.">The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta.</a> Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).</li><li>Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stromal+Cells+in+Combinatorial+Hydrogels+Containing+Cartilage+Matrix+Proteins+with+Decoupled+Mechanical+Stiffness.">Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li><li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intermittent+hydrostatic+pressure+and+BMP-2+on+osteoarthritic+human+chondrocyte+metabolism+in+vitro.">Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro.</a> J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).</li><li>Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+in+agarose+culture+synthesize+a+mechanically+functional+extracellular+matrix.">Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix.</a> J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).</li><li>Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+quantitation+and+discrimination+of+sulphated+glycosaminoglycans+by+use+of+dimethylmethylene+blue.">Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue.</a> Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).</li><li>Lai, J. H., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meniscus+and+cartilage+exhibit+distinct+intra-tissue+strain+distributions+under+unconfined+compression.">Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).</li><li>Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-rate+dependent+stiffness+of+articular+cartilage+in+unconfined+compression.">Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression.</a> Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).</li><li>Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+measurement+of+articular+cartilage+deformations+in+the+intact+human+hip+joint+under+load.">In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load.</a> The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).</li><li>Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+stresses+in+the+human+hip+joint.">Cartilage stresses in the human hip joint.</a> Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).</li><li>Benya, P. D., Shaffer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+chondrocytes+reexpress+the+differentiated+collagen+phenotype+when+cultured+in+agarose+gels.">Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels.</a> Cell. 30, 215-224 (1982).</li><li>Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage:+tissue+design+and+chondrocyte-matrix+interactions.">Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions.</a> Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).</li><li>Wang, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+chondroitin+sulphate+for+cartilage+tissue-biomaterial+integration.">Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration.</a> Nat Mater. 6, 385-392 (2007).</li><li>Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonding+and+fusion+of+meniscus+fibrocartilage+using+a+novel+chondroitin+sulfate+bone+marrow+tissue+adhesive.">Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive.</a> Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Zoals gemeld in dit protocol, 3D hydrogels kunnen chondrocyte fenotype te behouden in de cultuur, het vermijden van het proces van cel dedifferentiation in fibrocartilage cellen meestal ondervonden met monolaagkweken 15. Bovendien langdurige kweken van de chondrocytes- hydrogel construct bleek een gunstige omgeving die de intrinsieke cel functies die samenhangen met de leeftijd en ziekte handhaaft. Het gebruik van een 3D biomimetische hydrogel heeft verschillende voordelen. Ten eerste, het opnemen van chondroïtinesulfaat (CS), een belangrijke component in gewrichtskraakbeen staat cellen aan de hydrogel matrix afbreken secreteren chondroitinase en bepaalt nieuw gesynthetiseerde kraakbeen extracellulaire matrix 5, 16. Bovendien is CS aangetoond anti-inflammatoire eigenschappen in het gewrichtsontsteking hebben. De biomimetische hydrogel kan ook worden gebruikt als een stellage materiaal voor cellulaire levering kraakbeenherstel, en kunnen chemisch gemodificeerdbeter weefsel-biomateriaal integratie 17,18 vergemakkelijken. Het gebruik van PEG-hydrogelen CS maakt langdurige kweken van chondrocyten en de evaluatie van de biochemische en mechanische eigenschappen. Hier laten we zien hoe dit platform nuttig kan zijn voor de vergelijkende analyse van de verschillende bronnen van gedifferentieerde chondrocyten om de optimale celtype kraakbeen techniek definiëren. Interessant chondrocyten ingekapseld in hydrogels levensvatbaar blijft en prolifereren op basis van hun intrinsieke capaciteiten. De hydrogelsamenstelling dragers, namelijk de groei van gezonde jeugdige en volwassen chondrocyten zoals getoond in figuur 2. De samenstelling en de structuur van de beschreven hydrogelen bevordert ook de vorming van kraakbeenweefsel zoals aangegeven door de afzetting van een functionele extracellulaire matrix bepaald door glycosaminoglycaan (GAG ) kwantificering. Bijkomend voordeel is dat de chondrocyten-hydrogel constructenkan worden beoordeeld op de mechanische eigenschappen van het nieuw gevormde kraakbeenweefsel. Merk op dat het onbeperkte compressietest worden uitgevoerd op de acellulaire hydrogel ter vergelijking. De hydrogels, in feite, een intrinsieke stijfheid als gevolg van de stijfheid van het CS resten. Onbeperkte compressie stam van 5-20% (bij een vervormingssnelheid 1% / s) kunnen worden toegepast voor het mechanisch testen van kraakbeenweefsel 11,12 omdat de lichamelijke belasting ervaren door kraakbeenweefsel onder belastingstoestand werd gemeld dat 10-20 13,14%. De reactie van zowel cel-beladen en acellulair hydrogels mechanische testen werd geëvalueerd aan de cultuur eindpunt. In het beschreven voorbeeld hierboven zagen we een vergelijkbare stijfheid van de constructen bevattende volwassen en jonge chondrocyten in tegenstelling tot de lagere stijfheid van de constructen die OA chondrocyten. Dergelijke mechanische eigenschappen van de cel-hydrogel construct kan de beoordeling van de functionele eigenschappen van devormden weefsel geven van een grondige analyse van de cel rijping vermogen. Concluderend kan het gebruik van de 3D biomimetische hydrogels het potentieel van verschillende chondrocyte populatie studeren om kraakbeenweefsel te genereren schaal worden toegepast. Naast de in vitro studies beschreven, kunnen in vivo transplantatie van de cellen beladen constructen worden beoogd om celrijping en regeneratieve mogelijkheden bestuderen van de fysiologische context. Verdere modificaties van de hydrogel platform bijkomende biomimetische kunnen eveneens worden beoogd om chondrocyte proliferatie en maturatie optimaliseren.

With its limited self-repair potential, human articular cartilage undergoes frequent irreversible damages. Extensive efforts are currently focused on the development of efficient cell-based approaches for treatment of articular cartilage injuries. The success of these cell-based therapies is highly dependent on the selection of an optimal cell source and the maintenance of its regenerative potential. Chondrocytes are a common cell source for cartilage repair, but they are limited in supply and can de-differentiate during in vitro expansion in 2D monolayer culture thereby limiting their generation of hyaline cartilage 1. 
The aim of this protocol is to establish a 3-dimensional hydrogel platform for an in vitro comparative study of human chondrocytes from different ages and disease state. Unlike conventional two-dimensional (2D) culture, three-dimensional (3D) hydrogels allow chondrocytes to maintain their morphology and phenotype and provides a physiologically relevant environment enabling chondrocytes to produce cartilage tissue 2,3. In addition to providing a 3D physical structure for chondrocyte culture, hydrogels mimic the function of native cartilage extracellular matrix (ECM). Specifically, the inclusion of chondroitin sulfate methacrylate provides a potential reservoir for secreted paracrine factors 4 and enables cell-mediated degradation and matrix turnover 5. Although many 3D hydrogel culture systems have been utilized widely in various studies including agarose and alginate gels, we have used a biomimetic 3D culture system that has some distinct advantages for chondrocyte culture. Chondroitin sulfate (CS) is an abundant component in articular cartilage and the PEG-CS hydrogels have been shown to maintain and even enhance chondrogenic phenotype and facilitate cell-mediated matrix degradation and turnover 2,5. In addition, the mechanical properties of the hydrogel scaffold can be easily modulated by changing concentration of PEG and hence can be utilized to further enhance the regeneration potential of chondrocytes or a related cell type 6,7. PEG/CSMA is also biocompatible and hence has the potential for a direct clinical application in cartilage defects for example. The limitation for this system is its complexity and the use of photopolymerization that can potentially affect cell viability as compared to simpler systems like agarose, however the advantages for the chondrocyte culture outweigh the potential limitations.
The 3D hydrogel culture is compatible with conventional assay for evaluation of cell phenotype (gene expression, protein immunostaining) and functional outcome (quantification of cartilage matrix production, mechanical testing). This favorable 3D environment was tested to compare the tissue regeneration potential of human chondrocytes from three different aged populations in long-term 3D cultures. 
The outcomes were evaluated via both phenotypic and functional assays. Juvenile, adult and OA chondrocytes showed differential responses in the 3D biomimetic hydrogel culture. After 3 and 6 weeks, chondrogenic gene expression was upregulated in juvenile and adult chondrocytes but was downregulated in OA chondrocytes. Deposition of cartilage tissue components including aggrecan, type II collagen, and glycosaminoglycan (GAG) was high for juvenile and adult chondrocytes but not for OA chondrocytes. The compressive moduli of the resulting cartilage constructs also exhibited similar trends. In conclusion, both juvenile and adult chondrocytes exhibited chondrogenic and cartilage matrix disposition up to 6 weeks of 3D culture in hydrogels. In contrast, osteoarthritic chondrocytes revealed a loss of cartilage phenotype and minimal ability to generate robust cartilage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>juvenile chondrocytes (Clonetics&#8482; Normal Human Chondrocyte Cell System )</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adult chondrocytes (Clonetics&#8482; Normal Human Chondrocyte Cell System)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(ethylene glycol diacrylate)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-morpholinoethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photoinitiator</td>
			<td>Irgacure&#160;</td>
			<td align="right">2959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chondroitin sulfate sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoethyl methacrylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td align="right">132700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>HyClone, Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SH3002301&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>live/dead assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT&#8482; PicoGreen&#174; dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-dimethylmethylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0042-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instron 5944 testing system&#160;</td>
			<td>Instron Corporation</td>
			<td>E5940</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d hydrogel scaffolds for articular chondrocyte culture and cartilage generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Bioactieve hydrogels die PEG en CS groepen (figuur 1) vormen een ideaal platform voor de cultuur en de rijping van de menselijke articulaire chondrocyten 2,3,5,7. Chondrocyten van verschillende leeftijden en ziektetoestanden kunnen worden gekweekt bij de beschreven werkwijze en hun fenotype, genexpressie en biochemische en mechanische eigenschappen van het kraakbeenweefsel gegenereerde geanalyseerd. Drie chondrocyt monsters, juvenile- 6 maanden, volwassenheid 34 jaar en osteoarthritic- 74 jaar, werden geoogst na 3 weken van de cultuur in 3D biomimetische hydrogels. Genexpressie analyses van normale chondrocyten, zowel juveniele en volwassen, vertoonden een toename in de expressie van de genen chondrocyte COL2A1 en Col6a1. Integendeel, zieke chondrocyten toonden een dramatische verlaging van COL2A1 terwijl de expressie van Col6a1 (figuur 2) toont een verlies van chondrogene fenotype ondanks gekweekt in een gunstige biomimetische omgeving. De CS-PEG hydrogels ook dienen als een dynamische omgeving voor chondrocyten te laten groeien, verteren de bestaande matrix van PEG en CS en deponeren hun pericellulaire en extracellulaire matrix, de hoofdcomponenten van de volwassen kraakbeenweefsel. Gezien deze vermogens, chondrocyte expansie na 3 weken in vitro kweek kan worden geschat door kwantificering van DNA met de Picogreen kleurstof. Vergelijkende analyse van de drie groepen cellen blijkt dat de celdichtheid van jeugdige en volwassen populatie was onveranderd terwijl OA chondrocyten vertoonden een dramatische afname vergeleken met dag 1 van de kweek. Een verlies van DNA-gehalte werd waargenomen voor OA maar geen andere chondrocyten waarin mogelijke celdood tijdens de langdurige kweek (Figuur 3). Het uitgescheiden matrix werd gekwantificeerd als gesulfateerde GAG-gehalte DMMB-kleurstof bindingstest aan het eindpunt fase na 3 weken kweken. GAG inhoud wordt genormaliseerd door het natte gewicht van de hydrogel als Recorded voordat de enzymatische spijsvertering en de acellulaire bijdrage wordt afgetrokken. Zoals getoond in figuur 4, chondrocyten neergeslagen eenzelfde aanzienlijke hoeveelheid GAG gedurende 3 weken kweken in 3D hydrogels. De aanwezigheid van een scaffold fysieke maakt de evaluatie van de biomechanische eigenschappen van de monsters door middel onbeperkte compressietests 2,3. Terwijl acellulair hydrogels ondergaat een afname van de samendrukkende moduli, cellen beladen constructen handhaafde de samendrukkende moduli na 3 weken in kweek (Figuur 4). De fenotypische, biochemische en biomechanische analyse beschreven zijn daarom bruikbaar voor het evalueren en begrijpen van de potentie van verschillende chondrocyte populaties voor engineering van kraakbeen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> Figuur 1. PEG-CS biomimetische hydrogels voor 3D chondrocyte cultuur. chondrocyten opnieuw gesuspendeerd in een mengsel met poly (ethyleen glycol diacrylaat) (PEGDA) en chondroïtinesulfaat-methacrylaat (CS-MA) en gegoten in de maat cilindervormige gel vorm. Na blootstelling aan UV, gestolde gels worden verzameld uit de mallen en levensvatbaarheid van de cellen wordt bepaald door levend dood kleuring 24 uur na inkapseling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> Figuur 2. Expressie van chondrogene genen in menselijke chondrocyten gekweekt in 3D biomimetische hydrogels. Kwantitatieve genexpressie van kraakbeenmarkers COL2A1 en Col6a1 met juveniele, volwassenen en OA chondrocyten na 3 weken kweken in 3D biomimetische hydrogels. Waarden worden genormaliseerd om genexpressie niveau op dag 1. Fout bars vertegenwoordigen gemiddelde ± SD. * p &lt;0,05 zoals bepaald door een tweezijdige Student t-test. Gewijzigd van Smeriglio et al. 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> Figuur 3. DNA-gehalte in menselijke chondrocyten gekweekt in 3D biomimetische hydrogels. DNA kwantificering van Picogreen assay bij jonge, volwassen en OA chondrocyten na 3 weken van de cultuur in 3D biomimetische hydrogels. Waarden worden genormaliseerd om DNA-niveau op dag 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;br /&gt; Figuur 4. GAG gehalte meten en onbeperkte compressie test van de menselijke chondrocyten op dag 1 en na 3 weken van de cultuur in 3D biomimetische hydrogels. (A) GAG kwantificering van DMMB test in chondrocyten op dag 1 en na 3 weken van de cultuur in 3D biomimetische hydrogels. Waarden zijn genormaliseerd naar gewicht (ww) nat en uitgedrukt als ug / g. (B) compressiemodulus (kPa) van acellulaire en cel-beladen hydrogels op dag 1 en na 3 weken van de cultuur in 3D biomimetische hydrogels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation at JoVE.com

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D Hydrogel Stellingen voor Articulaire Chondrocyte Cultuur en Kraakbeen Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor Stem Cell Cultuur Toepassingen

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Een experimentele en Finite Element Protocol bij het vervoer van neutrale en geladen opgeloste stoffen over gewrichtskraakbeen Onderzoek

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting van kraakbeen en huid weefsel analogen met behulp van een roman passief mengen eenheid techniek voor Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Visualisatie in real time en analyse van chondrocyten letsel als gevolg van mechanische belasting in volledig Intact lymfkliertest kraakbeen explantaten

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Fabricage van Decellularized kraakbeen afkomstige Matrix steigers

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D afgedrukt poreuze Cellulose nanocomposietmaterialen Hydrogel steigers

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...