Name: plasmid-derived dna strand displacement gates for implementing chemical reaction networks
Uploaded: 2015-11-25T13:00:00
Duration: 7 min 50 s
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Figure 1, 2, 3, 4, 6, 8 e tabelle 2, 3, 10, 15, 16 vengono modificati dal Ref 29. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation (NSF concedere-CCF 1.117.143 e NSF-CCF 1.162.141 a GS). Y.-JC è stata sostenuta da borse di studio del governo di Taiwan. SDR è stato sostenuto dalla Science Foundation Graduate Research Fellowship Program Nazionale (GRFP).

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The authors declare no competing financial interests.

Questo documento descrive un metodo per derivare cancelli ndsDNA da DNA plasmidico altamente puro. Inoltre, un protocollo è presentato per caratterizzare prestazioni cancello usando un test cinetica di fluorescenza. Dati sperimentali mostrano che il sistema plasmide derivato supera la sua controparte sintetica anche se il sistema di sintesi viene assemblato con trefoli purificato usando SDS-PAGE (PAGINA). Probabilmente, il miglioramento delle prestazioni di cancelli plasmide derivato è dovuta principalmente alla elevatissima purezza del DNA biologica. DNA sintetico contiene una varietà di errori, in particolare delezioni che provocano oligonucleotidi di lunghezza tali prodotti collaterali n-1, e sono tipicamente non completamente rimosso in PAGE o cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) procedure di purificazione. Sono stati inoltre osservati miglioramenti simili a quelli riportati qui in un precedente studio di un amplificatore tornante catalizzata che usati DNA di origine biologica 21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Tuttavia, anche l&#39;utilizzo di porte plasmide derivato non può eliminare completamente gli errori nell&#39;esecuzione porta, per cui ci sono almeno due motivi: il primo over-digestione o la mancanza di precisione di taglio può portare a cancelli con troppe scheggiature o nick nelle posizioni sbagliate. In entrambi i casi, i gate sono più probabilità di partecipare a reazioni indesiderate. Tali problemi possono essere alleviati ottimizzando la quantità di enzima utilizzato (vedere Figura 4). In secondo luogo, in questi esperimenti, la maggior parte degli ingressi e trefoli ausiliari erano DNA sintetico e quindi contenevano delezioni e mutazioni. In linea di principio, tutti gli input a singolo filamento e fili supplementari potrebbero essere ottenuti anche dal DNA fagemide attraverso un enzima digestione intaccare del genoma virale M13 pre-codificato 26. Forse le prestazioni del circuito può essere ulteriormente migliorata utilizzando ssDNA derivata dal genoma batterico. Mentre è stato trovato l&#39;uso di porte plasmidi derivati ​​per migliorare le prestazioni del circuito, un&#39;analisidei costi e tempi di lavorazione rivelato che mentre la produzione di porte plasmide derivato è leggermente più economico (Tabella 15), richiede 2-3 volte più lungo tempo di lavorazione rispetto al montaggio e purificazione di porte da oligonucleotidi sintetizzati in commercio (Tabella 16). I costi primari di porte plasmide derivato sono sintesi genica e l&#39;impiego di enzimi di restrizione. Per 300 pmoli di cancelli (sufficienti per 15 reazioni 30 nm), il costo stimato per Iscriviti al cancello è di circa $ 170 e $ 200 per Forcella cancelli, la differenza di costo è dovuta all&#39;utilizzo di diversi enzimi intaccare. Al contrario, la sintesi chimica dei trefoli per gli stessi costi di gate intorno $ 260 compresa una commissione purificazione PAGE. Il costo orario principale per cancelli plasmide derivato è nella procedura di clonazione, che, come la sintesi del DNA, può essere affidata a una società di sintesi gene. Tuttavia, una volta assemblati, cancelli plasmide derivato hanno il vantaggio che i plasmidi ospitanti possono facilmente essere replicate unnd possono essere memorizzati in forma di scorte glicerolo batteriche. Ciò consente di riutilizzare le porte più volte. Guardando al futuro, il miglioramento delle prestazioni dei cancelli plasmide-derivato potrebbe consentire una gamma molto più ampia di dinamica dei comportamenti che sono stati sperimentalmente dimostrato finora con CRNS DNA. Ad esempio, di recente 47,48 lavoro teorico ha suggerito che i modelli spaziali autorganizzati alla macro-scala possono essere realizzate con DNA CRNS attraverso un meccanismo di diffusione di reazione. Il metodo qui presentato fornisce un percorso praticabile per costruire i componenti molecolari sottostanti per tali materiali DNA auto-patterning. Anche se impegnativo, lo sviluppo di morfologie macro-scala in modo programmabile avrebbe implicazioni significative in settori che vanno dalla ricerca biomateriali alla medicina rigenerativa.

La prevedibilità di Watson-Crick base di abbinamento è permesso nanotecnologia del DNA dinamico di emergere come un modo programmabile per la progettazione di dispositivi molecolari con proprietà dinamiche 1,2. In particolare, lo spostamento filamento di DNA - una reazione di ibridazione competitiva programmabile - ha dimostrato di essere un potente meccanismo di ingegneria dei sistemi dinamici di DNA. In una reazione spostamento filamento di DNA, un oligonucleotide arrivo sposta una ciocca precedentemente legato &quot;uscita&quot; da un partner di legame complementare. Molteplici tali reazioni possono essere concatenati in cascate di reazione multi-step con un alto grado di controllo sull&#39;ordine e la tempistica della reazione individuale passi 3. DNA cascate spostamento filone sono stati utilizzati per creare circuiti digitali e analogici molecolari 4-7, 8-10 nanostrutture commutabili, motori molecolari autonome 11-15, e non covalenti amplificatori catalitiche 13,16-21. Inoltre, DDispositivi NA utilizzando reazioni di spostamento dei filamenti possono essere simulati e progettati per diverse applicazioni utilizzando il software di progettazione assistita da computer 22-24. Attualmente, il DNA sintetizzato chimicamente serve come il materiale principale per le nanotecnologie del DNA. Tuttavia, gli errori nel processo di sintesi del DNA, e le conseguenti oligonucleotidi imperfetti, si ritiene che limitare le prestazioni dei dispositivi di Dynamic DNA, provocando reazioni collaterali errati. Ad esempio, reazioni &quot;fuga&quot; possono causare il rilascio di un oligonucleotide uscita anche in assenza di un trigger reazione. Tali effetti sono più evidenti in cascate di reazione autocatalitiche dove anche una minima quantità di perdita iniziale eventualmente sfociare nella piena attivazione della cascata 19,20. Viceversa, reazioni spesso non riescono a raggiungere il livello atteso di attivazione perché alcuni componenti non attivano anche in presenza dell&#39;ingresso previsto 7,25. Per rendere le prestazioni di DNA-basednanodispositivi paragonabili alle loro controparti a base di proteine ​​biologiche, tali modalità di errore devono essere drasticamente ridotto. Plasmidi batterici o altro DNA biologico potrebbe servire come fonte relativamente a buon mercato di DNA altamente puro per applicazioni nanotecnologiche. Grandi quantità di DNA possono essere generati dalla replica nei batteri e le capacità di correzione di bozze intrinseche dei sistemi viventi garantiscono la purezza del DNA risultante. In effetti, diversi lavori recenti hanno riconosciuto la potenziale utilità del DNA biologico per applicazioni nanotecnologiche 21,26-28. Tuttavia, la natura completamente a doppio filamento di DNA plasmide ha finora vietato l&#39;uso come materiale per la realizzazione di dispositivi di DNA dinamici, normalmente rappresentato più oligonucleotidi e contengono entrambi i domini doppio filamento e singolo filamento. In un recente lavoro 29 questo problema è stato affrontato e una nuova architettura porta DNA che consiste principalmente di intaccate DNA a doppia elica (ndsDNA) era introdurred. È importante sottolineare che i sistemi di porte ndsDNA possono essere progettati che realizzano le dinamiche specificato da una rete formale reazione chimica (CRN) 29. cancelli ndsDNA potrebbero quindi essere utilizzati, in linea di principio, di creare sistemi dinamici che presentano oscillazioni e il caos, bistabilità e la memoria, la logica booleana o comportamenti algoritmici 30-38. Ad esempio, Rif. ​​29 hanno dimostrato una CRN tre reazione che ha fornito un&#39;implementazione molecolare di un protocollo &quot;consenso&quot;, un tipo di algoritmo di calcolo distribuito 29,39,40. Questo primo lavoro ha dimostrato un nuovo uso per il formalismo CRN come un &quot;linguaggio di programmazione&quot; per la rapida sintesi di sistemi molecolari funzionali (Figura 1A). Qui, è previsto un protocollo dettagliato per ricavare porte ndsDNA dal plasmide DNA. Il primo è una revisione del processo di progettazione sequenza. Segue una spiegazione di oligonucleotidi sintetici contenenti comele sequenze del cancello vengono clonati in plasmidi e la sequenza verificate e amplificati tramite coltura batterica. Successivamente, è mostrato come ndsDNA porte possono essere derivati ​​da plasmidi di trattamento enzimatico (vedere Figura 2). Infine, un metodo per testare il comportamento cancello utilizzando saggi cinetici fluorescenza è delineato. Meccanismo di reazione Come esempio, il protocollo si concentra sulla reazione chimica catalitica A + B-&gt; B + C. Le specie A, B, e C (&quot;segnali&quot;, Figura 1B) tutti corrispondono ad una diversa molecola di DNA a singolo filamento. Le sequenze di queste molecole sono completamente indipendenti ed i fili non reagiscono uno con l&#39;altro direttamente. Le sequenze di tutti i segnali hanno due differenti domini funzionali, cioè sottosequenze che agiscono insieme a reazioni di spostamento strand: 1) un punto d&#39;appoggio a dominio breve (etichette ta, tb, tc) che viene utilizzato per l&#39;avvio di filo spostamento reaction, e 2) una lunga dominio (etichette a, b, c), che determina l&#39;identità del segnale. Le interazioni tra fili del segnale sono mediati da intaccate DNA (ndsDNA) complessi a doppia elica del cancello (chiamati Join AB e forcella aC) e ausiliari di specie a singolo filamento (&lt;tr r&gt;, &lt;b tr&gt;, &lt;c tb&gt; e &lt;i tc &gt;). La reazione A + B- formale&gt; B + C viene eseguito attraverso una serie di stadi di reazione di spostamento del filo, in cui ogni stadio di reazione espone un punto d&#39;appoggio per una successiva reazione (Figura 1B). In questo esempio, i segnali A e B sono inizialmente libere in soluzione mentre il segnale C è legato al cancello forcella. Al termine della reazione B e C sono in soluzione. Più in generale, i segnali che sono associati a un cancello sono inattive mentre i segnali che sono liberi in soluzione sono attivi, cioè, essi possono partecipare a una reazione di spostamento del filo comeun ingresso. Il decorso della reazione viene seguito mediante una strategia reporter fluorescente (Figura 1C). Nel precedente lavoro 29, è stato dimostrato che questo meccanismo di reazione realizza non solo la stechiometria corretta ma anche la cinetica della reazione di destinazione.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0531S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PvuII-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3151L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth, Modified</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0918-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Hispeed Maxi-prep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nb.BsrDI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0648L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nt.BstNBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0607L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-stranded Genomic Blocks</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 Fluorimeter</td>
			<td>Horiba/Jobin Yvon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Quartz Cells&#160;</td>
			<td>Starna</td>
			<td>23-5.45-S0G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Backbones</td>
			<td>BioBrick</td>
			<td>E0240-pSB1A2</td>
			<td>High copy number plasmid with Ampicillin resistance. Sequence can be found from http://parts.igem.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plasmid-derived dna strand displacement gates for implementing chemical reaction networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

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Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Plasmidi derivati ​​da DNA Strand Displacement Cancelli per reti di reazione implementazione chimici

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