Name: use of the ramsay assay to measure fluid secretion and ion flux rates in the drosophila melanogaster malpighian tubule
Uploaded: 2015-11-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule at JoVE.com

The authors wish to thank Drs. Sung-wan An and Mike O&#8217;Donnell for practical advice on establishing this assay, Dr. Chih-Jen Cheng for helpful discussions on the use of ion-specific electrodes, and Dr. Chou-Long Huang for his mentorship and support. This work was supported by the National Institutes of Health (K08DK091316 to ARR) and the American Society of Nephrology Gottschalk Award to ARR.

<html> 1. Vorbereiten der Sezierung, Kalibrierung und Test Geschirr Hinweis: In diesem Schritt werden drei Kunststoff-Petrischalen mit Silikon-Elastomer ausgekleidet zubereitet: eine für die Präparation, eine für die Durchführung der Ramsay-Test (&quot;Test Gericht&quot;), und eine für die Kalibrierung. Diese Gerichte werden aus dem Experiment wiederverwendet, zu experimentieren, und so dieser Schritt muss nur dann, wenn ein Gericht Pausen wiederholt werden. Ein Bild des Assays Schale wird...

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	<li>Ramsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Transport+of+Water+by+the+Malpighian+Tubules+of+the+Stick+Insect,+Dixippus-Morosus+(Orthoptera,+Phasmidae).">Active Transport of Water by the Malpighian Tubules of the Stick Insect, Dixippus-Morosus (Orthoptera, Phasmidae).</a> J Exp Biol. 31, 104-113 (1954).</li><li>Dow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+malpighian+tubules+of+Drosophila+melanogaster:+a+novel+phenotype+for+studies+of+fluid+secretion+and+its+control.">The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control.</a> J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).</li><li>Brand, A. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypotonicity+Stimulates+Potassium+Flux+through+the+WNK-SPAK/OSR1+Kinase+Cascade+and+the+Ncc69+Sodium-Potassium-2-Chloride+Cotransporter+in+the+Drosophila+Renal+Tubule.">Hypotonicity Stimulates Potassium Flux through the WNK-SPAK/OSR1 Kinase Cascade and the Ncc69 Sodium-Potassium-2-Chloride Cotransporter in the Drosophila Renal Tubule.</a> J Biol Chem. 289, 26131-26142 (2014).</li><li>Blumenthal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+tyramine+signaling+by+osmolality+in+an+insect+secretory+epithelium.">Modulation of tyramine signaling by osmolality in an insect secretory epithelium.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, 1261-1267 (2005).</li><li>Dow, J. A., Maddrell, S. H., Davies, S. A., Skaer, N. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+cation+transport+by+Malpighian+tubules+of+Drosophila+melanogaster:+application+of+two+novel+electrophysiological+methods.">Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods.</a> J Exp Biol. 207, 2173-2184 (2004).</li><li>Donnell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Too+much+of+a+good+thing:+how+insects+cope+with+excess+ions+or+toxins+in+the+diet.">Too much of a good thing: how insects cope with excess ions or toxins in the diet.</a> J Exp Biol. 212, 363-372 (2009).</li><li>Cheng, C. J., Truong, T., Baum, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney-specific+WNK1+inhibits+sodium+reabsorption+in+the+cortical+thick+ascending+limb.">Kidney-specific WNK1 inhibits sodium reabsorption in the cortical thick ascending limb.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 303, 667-673 (2012).</li><li>Cheng, C. J., Yoon, J., Baum, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STE20/SPS1-related+Proline/alanine-rich+Kinase+(SPAK)+is+Critical+for+Sodium+Reabsorption+in+Isolated+Perfused+Thick+Ascending+Limb.">STE20/SPS1-related Proline/alanine-rich Kinase (SPAK) is Critical for Sodium Reabsorption in Isolated Perfused Thick Ascending Limb.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li></ol>

Die Verwendung des Ramsay Assay zusammen mit ionenspezifischen Elektroden, ermöglicht die Messung der Fluid Sekretionsraten und Ionenströme in isolierten Insekten Malpighian (Niereninsuffizienz) Tubuli. Zwanzig oder mehr Tubuli kann zu einem Zeitpunkt untersucht werden, was einen höheren Durchsatz im Vergleich zu dem Assay in vitro einzelne microperfused Tubuli. Zusätzlich ionenspezifischen Elektroden erlauben die Bestimmung von Ionenkonzentrationen in der sekretierten Flüssigkeit in situ, die Beg...

<html> Nierenepithelzellen Ionentransport zugrunde organismal iono- und Osmoregulation. Die Drosophila melanogaster Malpighischen (Nieren) Tubulus bietet eine einmalige Gelegenheit, um die molekularen Mechanismen der epithelialen Ionentransport zu studieren. Dies ist aufgrund der Kombination der leistungsfähigen Genetik von Drosophila, gepaart mit der Zugänglichkeit der Nierentubuli auf physiologische Studie. Die Ramsay Assay, nach dem Forscher, der die Technik 1 Pionier benannt, misst Flüssigkeitssekretion Raten von isolierten Malpighischen, und wurde in Drosophila 1994 von Dow und Kollegen 2 etabliert. Dies ebnete den Weg für weitere Studien unter Verwendung von Drosophila genetische Werkzeuge, wie beispielsweise die GAL4-UAS-System 3,4, um zellspezifische Signalwege regulieren Flüssigkeitssekretion definieren. Ein Beispiel beinhaltet Calcium-Signal in Reaktion auf ein Peptidhormon, 5, unter vielen anderen 6,7. ve_content &quot;&gt; eine Kombination von genetischen Techniken und klassischen physiologischen Studie hat gezeigt, dass Urin-Generation gezeigt, in die Fliege durch die Sekretion eines Kaliumchlorid-reiche Flüssigkeit aus dem Hauptsegment der Röhrchen erfolgt. erfolgt dies durch die parallele transepithelialen Sekretion von Kationen, in erster Linie K +, sondern auch Na +, durch die Hauptzelle und Cl -. Sekrets durch die Sternzellen 8-12 Die Fähigkeit, transepithelialen K + und Na + Flüsse getrennt zu messen ermöglicht eine genauere Charakterisierung von Transportmechanismen als die Messung Flüssigkeitssekretion allein, z. B. in unstimulierten Drosophila Tubuli, die Na + / K + -ATPase-Inhibitors Ouabain hat keine Auswirkung auf Flüssigkeitssekretion 2, auch wenn ihre Aufnahme in den Hauptzellen wird durch den organischen Anionentransporter Inhibitor Taurocholat 13 gesperrt. Jedoch Linton und O&#39;Donnell zeigte, dass Ouabain depolarisiertder basolateralen Membranpotential und erhöht Na + Fluss 9. Wie in den Repräsentative Ergebnisse gezeigt, repliziert haben wir die Ergebnisse und zeigte, daß K + Flußmittel gleichzeitig um 14; die erhöhte Na + Fluss und verminderte K + Fluss haben entgegengesetzte Auswirkungen auf Flüssigkeitssekretion, was zu keiner Nettoänderung der Sekretion. So gibt es zwei Entschließungen zum &quot;Ouabain Paradox&quot;, das heißt, die anfängliche Beobachtung, dass keine Auswirkung auf Flüssigkeitssekretion im Drosophila-Röhrchen Ouabain:. Zunächst in stimulierten Tubuli, ist nicht ersichtlich, die Wirkung von Ouabain auf Flüssigkeitssekretion aufgrund seine Aufnahme durch den organischen Anionentransporter 13; und zweitens, in unstimulierten Tubuli, Ouabain hat gegenläufige Effekte auf transepithelialen Na + und K + Fluss, was zu keiner Nettoänderung der Flüssigkeitssekretion (siehe Repräsentative Ergebnisse und ref. 9). Die primäre Rolle der Na + / K + -ATPase in unstimulierten Tubuli ist es, intrazellulären Na + -Konzentration zu senken, um eine günstige Konzentrationsgradienten zu erzeugen für die Na + -gekoppelten Transportprozesse in der basolateralen Membran. Tat kann durch separates Messen Na + und K + Flüsse zeigten wir, dass Tubuli fehlt die Fliege Natrium-Kalium-2-Chlorid-Cotransporter (NKCC) haben transepithelialen K + Flusses vermindert, wobei keine weitere Abnahme nach Ouabain hinaus und keine Veränderung des transepithelialen Na + Fluss 14. Diese Ergebnisse unterstützten unsere Schlussfolgerung, dass Na + in die Zelle durch die NKCC wird durch die Na + / K + -ATPase recycelt. In einem anderen Beispiel Ianowski et al. Beobachtet, dass die Senkung Bad K + -Konzentration von 10 mM bis 6 mM verringert transepithelialen K + Flußmittel und erhöht den transepithelialen Na + Flusses in Tubuli aus Rhodnius prolixus, ohne Nettoänderung in Flüssigkeitssekretion <sup&gt; 15. Unterschiedliche Auswirkungen auf Na + und K + Flussflusses über Larven Tubuli wurden auch in Drosophila Tubuli als Reaktion auf variierende Salzdiäten 16 und in zwei Mückenarten in Reaktion auf die Aufzucht Salinität 17 beobachtet worden. Die größte Herausforderung bei der Messung des transepithelialen Ionenfluß im Ramsay Probenaufbereitung ist die Bestimmung von Ionenkonzentrationen in der sekretierten Flüssigkeit. Diese Herausforderung hat mit unterschiedlichen Lösungen, einschließlich flamm photometery 18, Verwendung von radioaktiven Ionen 19 und Elektronensonde Wellenlänge Spektroskopie 20 erfüllt sind. Diese Techniken erfordern Übertragung des sekretierten Fluidtropfen auf ein Instrument zur Messung von Ionenkonzentrationen. Da das Volumen der Flüssigkeit durch den unstimulierten Drosophila Tubulus sekretiert ist klein, typischerweise ~ 0,5 nl / min, stellt dies eine technische Herausforderung dar und führt auch Fehler, wenn einige der sekretierten Flüssigkeitverlor bei der Übertragung. Im Gegensatz dazu die Verwendung von ionenspezifischen Elektroden ermöglicht die Messung der Ionenaktivität (von dem Ionenkonzentration berechnet werden kann) in situ. Das aktuelle Protokoll wurde von dem von Maddrellschem und Kollegen zur transepithelialen K + Flusses über die Rhodnius Tubulus Messung mit Valinomycin als Ionophor K + 21 angepasst, und beschreibt auch die Verwendung eines 4-tert-Butylcalix [4] aren-tetraessigsäure Tetraethylester basierten Na + -spezifische ionenspezifischen Elektrode, gekennzeichnet durch Messerli et. al. 22. Ionenspezifischen Elektroden wurden ebenfalls verwendet, um die Ionenkonzentrationen in Flüssigkeit durch Malpighischen im Ramsay Assay bei Erwachsenen 9,23 und 16 Larven Drosophila melanogaster sezerniert zu messen, der Neuseeland-Alpine Weta (Hemideina maori) 24 und in Moskitos 17. Hier beschreiben wir im Detail die Verwendung des so Ramsaysage Flüssigkeitssekretion Raten in Malpighischen von Drosophila melanogaster, sowie die Verwendung von ionenspezifischen Elektroden, die Konzentrationen von K + und Na + innerhalb von sekretierten Flüssigkeit zu bestimmen und somit die Berechnung der transepithelialen Ionenflüsse zu messen. Eine Übersicht des Tests ist in Figur 1 vorgesehen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53144/53144fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Vasa Malpighi und der Ramsay-Assay unter Verwendung von ionenspezifischen Elektroden, die an Ionenkonzentrationen zu messen. Diese Abbildung zeigt das Setup für die Ramsay Assay. (A) Jede Fliege hat vier Röhrchen, ein Paar von vorderen Tubuli und ein Paar von hinteren Tubuli, die schwimmen in der Bauchhöhle von Hämolymphe umgeben. In jedem Paar, verbinden die beiden Röhrchen in den Harnleiter, die dann leert den Urin an der Kreuzung des Mitteldarms und hindgut. Die Röhrchen sind blind digen. Urin wird durch die (in rot dargestellt) Flüssigkeit absondernden Hauptsegment erzeugt und strömt in Richtung des Harnleiters und hinaus in den Darm. Nach der Präparation wird die Tubuli Paar aus dem Darm durch Durchtrennung des Harnleiters dissoziiert. (B) Das Paar von Röhrchen wird dann in einen Tröpfchenbadesalzlösung innerhalb einer Vertiefung des Assays Schale überführt. Eines der beiden Röhrchen, hier als die &quot;Anker Tubulus&quot; ist um einen Metallstift gewickelt und ist inert. Die andere Röhrchen ist die sezernierenden Röhrchen. Das Anfangssegment (die nicht Flüssigkeit sezerniert) und Hauptsegment der sezernierenden Röhrchen bleiben innerhalb des Tröpfchens des Badens Kochsalzlösung. Ionen und Wasser Umzug von der Badekochsalzlösung und in die Tubuluslumen des Hauptsegments und dann in Richtung des Harnleiters zu bewegen, wie es in vivo auftreten. Das untere Segment (blau) ist außerhalb der Badesalzlösung und daher inert. Da der Harnleiter geschnitten wird, tritt der sekretierten Flüssigkeit als ein Tröpfchen von dem geschnittenen Ende des Ureters. Ter sezerniert Fluidtröpfchen vergrößert Laufe der Zeit als Sekret setzt, und sein Durchmesser wird unter Verwendung eines okularen Mikrometers gemessen. Eine Schicht von Mineralöl verhindert die Verdunstung des sekretierten Flüssigkeit. Die Referenz- und ionenspezifische Elektroden messen die Ionenkonzentration der Flüssigkeit ausgeschieden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades #1</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 30G x 1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305106</td>
			<td>Use appropriate sharps precautions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins, black anodized, 0.15 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td>Specific brand is not important; this is given as an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick</td>
			<td>Hobby shop</td>
			<td></td>
			<td>Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)</td>
			<td>Hobby shop</td>
			<td></td>
			<td>Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>30-0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>30-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid, 70%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>438073</td>
			<td>CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cimarec 7 in x 7 in hotplate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11675911Q</td>
			<td>Specific brand is not important; caution when heated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectophore dichlorodimethylsilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40136-1ML</td>
			<td>CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-step vertical pipet puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td>Other pipet pullers can be used; this is given as an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-748E</td>
			<td>Specific brand is not important; only one dish needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-821-852</td>
			<td>May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S161-500</td>
			<td>Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>World Precision Instruments MicroFil, 34G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-821-914</td>
			<td>May be available from other distributors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe with luer lock</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td>May be available from other distributors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe with luer lock</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309657</td>
			<td>May be available from other distributors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-30600-02</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Locking Connector</td>
			<td>4 Medical Solutions</td>
			<td>ADC 9873-10</td>
			<td>Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-179-110</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14171208</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectophore potassium ionophore I, cocktail B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>99373</td>
			<td>CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectophore sodium ionophore X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71747</td>
			<td>Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>73732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectophore sodium tetraphenylborate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21720024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High impedance electrometer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD223a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder 1 mm with 45&#176; body, vented, with handle</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators, pair</td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
			<td>Various brands/models will work; this is an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
			<td>81-334-03</td>
			<td>This is an example; any Faraday cage will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single gooseneck fiberoptic light</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-2629</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, Dumont #5 with Biologie tip</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>May be available from other distributors.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the ramsay assay to measure fluid secretion and ion flux rates in the drosophila melanogaster malpighian tubule

Modulation Nierenepithelzellen Ionentransport erlaubt Organismen ionische und osmotische Homöostase angesichts der unterschiedlichen äußeren Bedingungen aufrechtzuerhalten. Die Drosophila melanogaster Malpighischen (Nieren) Tubulus bietet eine einmalige Gelegenheit, um die molekularen Mechanismen der epithelialen Ionentransport zu untersuchen, aufgrund der leistungsfähigen Genetik dieses Organismus und der Zugänglichkeit ihrer Nierentubuli auf physiologische Studie. Hier beschreiben wir die Verwendung des Ramsay Assayfluid Sekretionsraten von isolierten fly Nierentubuli zu messen, mit der Verwendung von ionenspezifischen Elektroden, die Natrium- und Kaliumkonzentrationen in der sekretierten Flüssigkeit zu messen. Dieser Assay ermöglicht Studium der transepithelialen Flüssigkeit und Ionenflüsse von ~ 20 Tubuli zu einer Zeit, ohne die Notwendigkeit, das sezernierte Fluid zu einer separaten Vorrichtung zu übertragen, um die Ionenkonzentration zu messen. Genetisch unterschiedlichen Tubuli können analysiert werden, um die Rolle spezifischer Gene, die in Transportprozessen zu beurteilen. Zusätzlich wird die bathing Salzlösung kann geändert werden, um die Wirkungen der chemischen Eigenschaften oder Arzneimittel oder Hormone zugesetzt untersuchen. Zusammenfassend ermöglicht diese Technik die molekulare Charakterisierung der Grundmechanismen von epithelialen Ionentransport in Drosophila Tubulus sowie Regelung dieser Transportmechanismen.

Die 7 und 8 zeigen, dass die Verwendung des Ramsay Assay mit ionenspezifischen Elektroden gegenüber K + und Na + -Konzentration zu messen, kann die genetische und pharmakologisch verschieden K + und Na + Flüsse, Informationen, die nicht durch die Messflüssigkeit Sekretionsraten allein erfasst wird unterscheiden. Fig 7 zeigt, dass Fluid-Sekretion in Tubuli von Fliegen, die eine homozygote Nullmutation in der NKCC verringert wird durch eine A...

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Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des Ramsay Assay Flüssigkeitssekretion Raten von isolierten Malpighischen (Nieren) Tubuli aus Drosophila melanogaster zu messen. Darüber hinaus ist die Verwendung von ionenspezifischen Elektroden, die Natrium- und Kaliumkonzentrationen in der sekretierten Flüssigkeit zu messen, mit Berechnung der transepithelialen Ionenfluss, wird beschrieben.

Die Nutzung der Ramsay Assay zu Flüssigkeitssekretion und Ionenfluss Preise in der Maßnahme<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Malpighischen Tubulus

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Forschung

Biologie

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Klonogene Test: adhärenter Zellen

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

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Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) zu Chromatin Protein Dynamics in Living embryonalen Stammzellen Measure

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

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Insulin-Injektion und Hämolymphe Extraction die Insulinsensitivität in Adult Measure Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

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Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

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Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

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Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

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Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

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Mündliche bakterielle Infektion und Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...