Name: using confocal analysis of xenopus laevis to investigate modulators of wnt and shh morphogen gradients
Uploaded: 2015-12-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients at JoVE.com

Bir BBSRC tarafından finanse edildi Bu çalışma (BB / H010297 / 1), SAR bir BBSRC kota öğrenciliği ve SWF bir MRC öğrenciliği MEP hibe.

Etik deyimi: Hayvan deneyleri MEP İngiltere Ev ofis lisansı altında yapıldı ve yürütülen deneyler GELİYORUM uygun olarak University of York etik komitesi tarafından onaylandı: kurallar (Hayvan Research In Vivo Deneyler ve Raporlama). (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines). Floresan Tagged Ligandları oluşturmak için 1. Strateji Aşağıda çerçeve füzyonu Wnta-HA-eGFP oluşturmak üretilmesi amacıyla, PCS2 içine Wnt8a-HA ve ...

<ol>
	<li>Shen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+signaling:+developmental+roles+and+regulation.">Nodal signaling: developmental roles and regulation.</a> Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).</li><li>Shimmi, O., Newfeld, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+extracellular+and+post-translational+regulation+of+TGF-beta+family+signalling+pathways.">New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways.</a> J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).</li><li>Pownall, M. E., Isaacs, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, 1-75 (2010).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+in+development+and+disease.">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127 (3), 469-480 (2006).</li><li>Ingham, P. W., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+in+animal+development:+paradigms+and+principles.">Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles.</a> Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).</li><li>Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+hundred+years+of+positional+information.">One hundred years of positional information.</a> Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).</li><li>Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics,+spatial+range,+and+transcriptional+interpretation+of+the+Dorsal+morphogen+gradient.">Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).</li><li>Erickson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maintenance+of+morphogen+gradients:+an+essential+role+for+the+endomembrane+system+in+Drosophila+melanogaster+wing+development.">Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development.</a> Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).</li><li>Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+signalling+in+the+developing+limb.">Gradients of signalling in the developing limb.</a> Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).</li><li>Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+vertebrate+neural+tube:+a+sonic+hedgehog+morphogen-regulated+transcriptional+network.">Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network.</a> Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).</li><li>Briscoe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeobox+gene+Nkx2.2+and+specification+of+neuronal+identity+by+graded+Sonic+hedgehog+signalling.">Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling.</a> Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).</li><li>Ribes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Sonic+Hedgehog+signaling+dynamics+specify+floor+plate+and+ventral+neuronal+progenitors+in+the+vertebrate+neural+tube.">Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube.</a> Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).</li><li>Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+regulation+of+developmental+cell+signaling+by+XtSulf1.">Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1.</a> Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).</li><li>Tao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+wnt11+activates+the+canonical+wnt+signaling+pathway+required+for+axis+formation+in+Xenopus+embryos.">Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos.</a> Cell. 120 (6), 857-871 (2005).</li><li>Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord-derived+Shh+concentrates+in+close+association+with+the+apically+positioned+basal+body+in+neural+target+cells+and+forms+a+dynamic+gradient+during+neural+patterning.">Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning.</a> Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).</li><li>Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulf1+influences+the+Shh+morphogen+gradient+during+the+dorsal+ventral+patterning+of+the+neural+tube+in+Xenopus+tropicalis.">Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).</li><li>Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulf1+has+ligand+dependent+effects+on+canonical+and+non-canonical+WNT+signalling.">Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling.</a> Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).</li><li>Dytham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Choosing and using statistics : A biologist's guide. , (2005).</li><li>Fay, M. P., Proschan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wilcoxon-Mann-Whitney+or+t-test?+On+assumptions+for+hypothesis+tests+and+multiple+interpretations+of+decision+rules.">Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules.</a> Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).</li><li>Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xwnt-8,+a+Xenopus+Wnt-1+/int-1-related+gene+responsive+to+mesoderm-inducing+growth+factors,+may+play+a+role+in+ventral+mesodermal+patterning+during+embryogenesis.">Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis.</a> Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).</li><li>Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+classes+and+functional+domains+of+Wnts+through+expression+of+wild-type+and+chimeric+proteins+in+Xenopus+embryos.">Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).</li><li>Tada, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xwnt11+is+a+target+of+Xenopus+Brachyury:+regulation+of+gastrulation+movements+via+Dishevelled,+but+not+through+the+canonical+Wnt+pathway.">Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway.</a> Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).</li><li>Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+long-range+movement+of+the+morphogen+Xnr2+in+the+Xenopus+embryo.">Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo.</a> Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).</li><li>McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+has+direct+long-range+signalling+activity+and+can+form+a+concentration+gradient+by+diffusion.">Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion.</a> Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).</li><li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen.">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li><li>Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos+coincides+with+the+dorsal+enrichment+of+dishevelled+that+is+dependent+on+cortical+rotation.">Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation.</a> Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).</li><li>Schohl, A., Fagotto, F. B. e. t. a. -. c. a. t. e. n. i. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+and+Smad+signaling+during+early+Xenopus+development.">MAPK and Smad signaling during early Xenopus development.</a> Development. 129 (1), 37-52 (2002).</li><li>Muller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system.">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336, 721-724 (2012).</li><li>Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules.">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461, 533-536 (2009).</li><li>Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+Wnt+recognition+by+Frizzled.">Structural basis of Wnt recognition by Frizzled.</a> Science. 337, 59-64 (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2010).</li></ol>

Bu protokolün bir parçası, normal olarak, işlenmiş salgılanan ve bağlı bir floresan parçası olmasına rağmen, alıcı hücre içinde bir yanıt ortaya çıkarmak için, biyolojik olarak etkin ligandları oluşturuyor. Bu floresan etiketli gen ürünü, uygun bir deney kullanılarak biyolojik olarak aktif olduğunu belirlemek için çok önemlidir. Shh-GFP, PtC1 ekspresyonunu aktive etme kabiliyeti 16 doğrulandı. Wnt8a tek ventral blastomere 20-21 ile ifade edilmiştir ve Wnt8a...

Erken dönemde embriyo gelişimi sırasında, hücreler giderek farklılaşma spesifik soy takip kararlı Bu totipotent (veya pluripotent) bir hücre tipine neden kararlı projenitör hücrelerin popülasyonları kuran giderek kısıtlı hale hücre grubu anlamına gelir. Hücre-hücre sinyal embriyonik gelişim sırasında soy şartnamenin düzenlenmesi merkezidir. Bu sinyallerin idaresi ise, yeni tıbbi tedaviler destek, özellikle kaderi doğru kök hücreleri yönlendirmek için gerekli olacaktır. Sinyal yollarının nispeten az sayıda TGF süper ailesinin (nodals ve BMPler) 1-2, FGF&#39;ler 3, Wnts 4 ve kirpi 5 yanıt yolakları dahil olmak üzere gelişme sırasında tekrarlanır. Bu proteinler böylece gen salgılanan ekspresyonunu ve / veya hücre davranışını değiştirerek sinyal iletimini etkinleştirmek için hücre zarı üzerinde mevcut olan reseptörlerine bağlanır. Hücre işareti sıkı düzenlemeAlling hücre soyu özellikleri ve normal gelişim için gereklidir. Bu yollar arasında cross-talk hücre kaderini belirlemede önemli olmakla birlikte, tek bir ligand kendisi farklı konsantrasyonlarda farklı tepkiler olabilir. Morfojen degrade hücre tipleri hücrelerin 6 bir alandan elde edebilirsiniz ne kadar farklı açıklamak için bir teori olarak 100 yıl önce tarif edildi. Hücrelerin bir grup tarafından üretilen moleküller Sinyal kaynağı daha büyük bir mesafe ile konsantrasyonunu azaltarak, belirli bir aralık içinde yayılabilir. Sinyaline maruz hücreler farklı pozisyonlarda yer alan hücreler sinyalin farklı seviyelerde farklı yanıt olan, hücre alanındaki pozisyonda lokal konsantrasyona yanıt verecektir. Morphogens varlığı için kanıt, erken Drosophila embriyo 7 ve kanat disk 8, hem de omurgalı bacak 9 ve nöral borunun 10 üzerinde yapılan çalışmalardan elde. Yöntemler için gerekli olanKurulan nasıl morfojen gradyanlar incelenmelidir ve bu geçişlerini düzenlenmesinde önemli diğer molekülleri tespit etmek. Farklı genetik arka bağlamında in vivo endogen proteinleri görselleştirmek için immünohistokimya kullanılarak zarif deneyler morfojen gradyanlar 11-12 araştırmak için kullanılmıştır. Ancak, iyi antikorlar ve spesifik mutantlar her zaman geçerli değildir, bu yüzden alternatif, ekzojen gen ürünleri hücre alanın karşısındaki ligandların dağılımını nasıl etkilediği incelemek için basit bir yöntem sağlamak, Xenopus floresan ligandların aşın kullanarak burada bir protokol açıklar. Xenopus laevis onlar erken evrelerinde erişilebilir, böylece onların embriyoların dışarıdan geliştirmek gibi deneyler bu tür üstlenmek için mükemmel bir sistem sağlar. Onlar (yine yaklaşık 20 nispeten büyük olduğundan onların büyük boy (çapı 1-1.5mm) mikroenjeksiyon ve cerrahi manipülasyon kolaylaştırır ve blastula aşamaları ile hücrelerin görüntüye kolay81;) karşısında değilim. Xenopus overekspresyonu çalışmaları yapmak basit: Erken embriyo enjekte mRNA belirli hücrelere hedeflenebilir ve verimli çevrilmiştir. Floresan etiketli Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP konstruktları PCS2 Wnt8a-HA 13, PCS2 Wnt11b-HA 14 ve eGFP kullanılarak üretilmiştir. HA peptid gen ürünleri hem de çalışması için izin Wnt ve eGFP proteinleri ayıran bir ara parçası olarak işlev gördüğü tahmin edilmektedir, çünkü ek bir moleküler etiket sağlar, ancak aynı zamanda sadece dahil etmek çok önemlidir. Shh&#39;nin görüntülenmesi için kullanılan konstrukt, daha önce bir Shh-EGFP füzyon proteinini 15 eksprese eden transgenik bir fare üretmek için kullanılmıştır; Bu nazik Andy McMahon tarafından sağlandı. Önemli bir şekilde, bütün konstruktlar için olan GFP etiketi işleme sonra da baki kalmaktadır şekilde sinyal sekansına 3 &#39;klonlanır. Nihai protein tadil etme için gereken dizileri, bu additio içerir sağlamak da önemlidirgibi lipitler n sentetik mRNA prodution için optimize edilmiş pCS2 sentezleme vektörüne alt-klonlanmıştır Shh ve Wnt ligands.The cDNA&#39;lar için geçerlidir; bir SP6 başlatıcısını içeren ve poliadenilasyon sinyali (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors) içerir. Burada anlatılan çalışma salgılanmasını ve floresan difüzyon karşılaştırmak için basit bir protokol Wnt ve Shh ligandlar tagged sağlar. Sentetik mRNA belirlenen miktarda enjekte edilerek, protokol farklı promotörler kullanarak farklı vektörler değişken ekspresyonu ile bağlantılı herhangi bir sorun çevrelemiyor. Bu yöntemler son zamanlarda Şşş-eGFP ve Wnt8a / Ksenopus 16-17 in Wnt11b-HA-eGFP salgılanması ve difüzyon heparan sülfat endosulfatase Sulf1 etkilerini araştırmak amacıyla uygulanmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Melford</td>
			<td>MB 1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>From Megascript SP6 Kit AM 1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicarbonate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>RC-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C13961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap analog (m7G(5&#39;))</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM 8050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O3690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F 4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image J software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download http://fiji.sc/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>G 0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0400/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips, No.1.5&#160;</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Narishige PC -10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pull needles</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chronic gonadotropin (HCG)</td>
			<td>Intervet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/7500/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710 and Zen software (2008-2010)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>http://uk.mathworks.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 2819-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail varnish&#160;</td>
			<td>Boots</td>
			<td>Bar code 3600530 373048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Lab.tech International</td>
			<td>ND-1000 / ND8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (55mm)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>391-0865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>http://www.photoshop.com/products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High fidelity DNA polymerase and buffers&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>M0530S&#160; Buffer - M0531S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/4280/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC insulation tape</td>
			<td>Onecall</td>
			<td>SH5006MPK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>S28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes buffers</td>
			<td>Roche</td>
			<td colspan="2">SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>ME10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel back single edge blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>66-0403-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>27810.364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SHE 2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needles</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen lite software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download&#160; http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using confocal analysis of xenopus laevis to investigate modulators of wnt and shh morphogen gradients

Bu protokol, hücrelerin bir alanı boyunca dağıtılmış ligandlar görselleştirmek için bir yöntemi anlatmaktadır. Birlikte erken embriyolar kendi hücrelerinin büyük boyutu ile, eksojen proteinleri ifade kolaylığı, Xenopus GFP etiketli ligandların görüntülenmesi için yararlı bir model laevis olun. Sentetik mRNA verimli erken evre Xenopus embriyoların içine enjeksiyondan sonra çevrilir ve enjeksiyonlar tek bir hücre hedeflenebilir. Membran gergin RFP olarak soy izleyici ile kombine edildiğinde, Süreksprese protein üreten enjekte hücre (ve onun soyundan) kolayca takip edilebilir. Bu protokol, üretimi için bir yöntem olup, floresan enjekte mRNA&#39;dan Wnt ve Shh ligandlan etiketli açıklanmaktadır. Yöntemler mil dahilektodermal eksplantlar (hayvan kapaklar) ve çoklu örneklerinde ligand difüzyon analizi cro diseksiyonu. Confocal görüntüleme kullanarak, hücrelerin bir alanı üzerinde bir ligand salgılanması ve difüzyon ile ilgili bilgiler elde edilebilir. Konfokal görüntüleri İstatistiksel analizler ligand geçişlerini şekline nicel veri sağlamaktadır. Bu yöntemler morfojen geçişlerini şeklini düzenleyen faktörlerin etkilerini test etmek istediğiniz araştırmacılar için yararlı olabilir.

Floresan etiketli proteinleri ifade hayvan kap eksplant Konfokal analizi, farklı deneysel koşullar altında ligand dağılımını görselleştirmek için etkili bir sistem sağlar. Bir örnekte, GFP dağılımı Shh (Şekil 1) gösterilmiştir etiketli. 2 hücreli aşamada, Xenopus embriyolar bir kontrol mRNA ile veya mRNA Sulf1, hücre yüzeyi heparan sülfat değiştirir ve Shh morfojen gradyanı 16 etkileyen bir enzimi kodlayan halinde her iki her iki hücre enjekte edilir. Bu ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients at JoVE.com

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

El yazması burada Xenopus floresan levhası &#39;ligandların salgılanmasını ve difüzyon analiz yöntemleri basit bir kümesi sağlar. Bu ligand dağılımını değiştirmek için başka proteinlerin yeteneğini test ve morfojen degradeler düzenleyen mekanizmalar içgörü verebilir deneyleri izin verdiği için bir ortam sağlar.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

İletken Airways Desenlendirme sırasında Wnt Sinyalizasyonu incelenmesi

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Zebra balığı Çeneli Biyomekanik Araştırma Sonlu Elemanlar Modelleri Bina

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...