Name: unraveling entropic rate acceleration induced by solvent dynamics in membrane enzymes
Uploaded: 2016-01-16T15:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes at JoVE.com

The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.

<ol>
	<li>Ball, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+as+an+active+constituent+in+cell+biology.">Water as an active constituent in cell biology.</a> Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).</li><li>Snyder, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+hydrophobic+effect+in+the+biomolecular+recognition+of+arylsulfonamides+by+carbonic+anhydrase.">Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).</li><li>Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+is+Key+to+the+Formation+of+Pentacyclic+Terpenoids+by+Enzyme-Catalyzed+Polycyclization.">Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).</li><li>Persson, F., Halle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Access+to+the+Protein+Interior:+Simulation+versus+NMR.">Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).</li><li>Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Active-Site+Solvent+in+the+Thermodynamics+of+Factor+Xa+Ligand+Binding.">Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).</li><li>Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Displacing+Water+Molecules+from+Protein+Binding+Sites:+Consequences+for+Ligand+Optimization.">Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).</li><li>Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+water+transfer+energy+to+protein-ligand+association+and+dissociation+barriers:+Watermap+analysis+of+a+series+of+p38&#206;&#177;+MAP+kinase+inhibitors.">Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38&#206;&#177; MAP kinase inhibitors.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).</li><li>Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motifs+for+molecular+recognition+exploiting+hydrophobic+enclosure+in+protein-ligand+binding.">Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).</li><li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-Mediated+Recognition+of+Simple+Alkyl+Chains+by+Heart-Type+Fatty-Acid-Binding+Protein.">Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).</li><li>Pavlova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesigning+dehalogenase+access+tunnels+as+a+strategy+for+degrading+an+anthropogenic+substrate.">Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).</li><li>Breiten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Networks+Contribute+to+Enthalpy/Entropy+Compensation+in+Protein-Ligand+Binding.">Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).</li><li>Oldfield, E., Lin, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terpene+biosynthesis:+Modularity+rules.">Terpene biosynthesis: Modularity rules.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 51 (5), 1124-1137 (2012).</li><li>Henzler-Wildman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+timescales+in+protein+dynamics+is+linked+to+enzyme+catalysis.">A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis.</a> Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).</li><li>Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+activity+regulation+by+conformational+entropy.">Protein activity regulation by conformational entropy.</a> Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+origin+of+the+catalytic+power+of+enzymes+and+the+role+of+preorganized+active+sites.">Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites.</a> J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).</li><li>Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+optimal+use+of+empirical+energy+functions:+Force-field+parameterization+in+crystal+space.">Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).</li><li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-charge+force+field+for+molecular+mechanics+simulations+of+proteins+based+on+condensed-phase+quantum+mechanical+calculations.">A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations.</a> J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).</li><li>Essmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smooth+particle+mesh+Ewald+method.">A smooth particle mesh Ewald method.</a> J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).</li><li>Chovancova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAVER+3.0:+a+tool+for+the+analysis+of+transport+pathways+in+dynamic+protein+structures.">CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures.</a> PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708 (2012).</li><li>Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+and+site-saturation+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol.</a> Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).</li><li>K&#252;rten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+functional+human+oxidosqualene+cyclase+in+Escherichia+coli.">Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli.</a> Protein Express. Purif. , (2015).</li><li>Eyring, H., Stearn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+theory+of+absolute+reaction+rates+to+proteins.">The application of the theory of absolute reaction rates to proteins.</a> Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+in+protein+science:+a+guide+to+enzyme+catalysis+and+protein.">Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein.</a> , (1999).</li><li>Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+squalene+cyclase.">Structure and function of a squalene cyclase.</a> Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+enzymes+work:+analysis+by+modern+rate+theory+and+computer+simulations.">How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations.</a> Science. 303 (5655), 186-195 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الخطوات الأكثر أهمية في تحقيق جودة عالية البيانات الثرموديناميكيه التجريبية لالبرية من نوع الإنزيم الغشاء ونفق متغيرات هي: 1) توليد نموذج جهاز الكمبيوتر. 2) تنقية البروتينات متجانس. 3) أسهم الركيزة مستحلب. 4) السيطرة على درجة الحرارة خلال حركية. 5) استخراج مخاليط رد فعل باستخدام معيار الداخلية. توليد نموذج جهاز الكمبيوتر مما يسهل إلى حد كبير عن طريق استخدام برنامج مع واجهة سهلة الاستخدام التي تدعم مجموعة متنوعة من المنصات. وبالتالي، يقوم هذا البروتوكول على YASARA النمذجة جناح 16 لجعل استراتيجيتنا الوصول حتى إلى النمذجة غير الخبراء. ينبغي من الناحية المثالية أن يستند نموذج حاسوبي لتحديد نفق المياه على التركيب البلوري للانزيم من الفائدة 24. لهذا الغرض، وثروة من هياكل الكريستال المتوفرة في بنك المعلومات بروتين مفيد جدا. في تجربتنا، جانبا رئيسيا في نجاح إعداد تيملوحات لتحديد النفق هو الحفاظ على المياه البلورات. ومن الأهمية المتساوية لاستخدام مربع انزيم الإذابة بالإكترونات عند تنفيذ ديناميات المحاكاة الجزيئية، والتي يمكن تشغيلها على جهاز الكمبيوتر العادي. ومحلقة تريتيربيني من Alicyclobacillus acidocaldarius مستقرة في المياه خلال المحاكاة MD 3. ومع ذلك، وحفظ المنظفات البلورات و / أو استخدام يقلد غشاء الخلية من شأنه ربما تكون هناك حاجة لإنزيمات يحتمل أن تكون غير مستقرة للسماح لمحاكاة MD طويلة. ومن المتوقع أن التركيب البلوري التقليل من الأهداف الصعبة للغاية يمكن ان توفر معرفة الآلية الهامة باستخدام بروتوكول، على الرغم من أن هذا لن التقاط الجوانب الديناميكية للتنظيم النفق. CAVER 19 في الوضع الأساسي، مع واحد أو عدد محدود من لقطات كمدخل، يمكن استخدامها من قبل غير الخبراء على جهاز كمبيوتر محمول قياسي. بناء على خبرتنا 3 والأنفاق مع دائرة نصف قطرها عنق الزجاجة (أي نصف قطرهافي النقطة الأكثر الضيقة) أصغر من 1 Å يمكن أن تكون ذات أهمية كبيرة للمياه، وخاصة إذا كان يوجد جزيئات الماء البلورات داخل النفق وتوقع (الشكل 1، وسط يسار). من ناحية أخرى، يمكن لدائرة نصف قطرها أكبر عنق الزجاجة يعني نفق لنقل الركيزة في والخروج من موقع نشط 10. البرنامج النصي في القانون التكميلي ملف 2 يمكن استخدامها من قبل غير الخبراء لتصور الأنفاق المتوقعة. والتجارب في المستقبل تكشف ما إذا كانت نماذج التماثل ستكون عالية بما فيه الكفاية قرار للسماح لدراسة يملك ثرواتها فئات من شبكات المياه وديناميكية. تسليط الضوء على كيفية أداء ديناميات المحاكاة الجزيئية، مع وبدون يجند موجودة في موقع نشط، يؤثر فإن عملية تحديد نفق أيضا أن تكون ذات أهمية. يمكن حركية بروتينات الغشاء يشكل تحديا هائلا 25. بروتوكول هنا يستند إلى بروتوكول استخراج غشاء بسيطللحصول على انزيم غشاء من دون استخدام معدات باهظة الثمن، مثل نابذة فائقة السرعة. استخدام هلام الترشيح كخطوة تلميع النهائية يزيل الجزيئات المحتملة الغشاء المتبقية ويسمح لتحديد بيئة المنظفات المناسبة 25. أحد الجوانب الرئيسية في تحقيق نتائج الحركية استنساخه من البروتوكول هو لاستحلب محلول المخزون الركيزة التي ultrasonication. vortexing لبسيط من ركائز مسعور المخفف في المخزن المؤقت رد فعل غير متجانسة يعطي خليط من الركيزة المنظفات. وpipetting لحلول الركيزة غير مستحلب يؤدي إلى تركيزات irreproducible (أكدته GC الكمي)، مما يحول دون تحديد دقيق لمعدلات الأولية. في المقابل، يتعين على pipetting لحلول الأسهم مستحلب بشكل صحيح يؤدي في تحليل الانحدار الخطي من المعدلات الأولية مع R 2 في نطاق 0،98-0،99. جانب آخر مهم من ركائز مسعور هو الركيزة الذوبان واضحوتوفر في مخاليط الركيزة المنظفات. في الواقع، لم يكن من الممكن لتشبع محلقة تريتيربيني مع السكوالين الركيزة المرجعية. لهذا السبب واضح ك القط / يتم عرض القيم K M هنا التي يمكن أن تحتوي على مساهمات من الملزمة والكيمياء. ومع ذلك، فقد تبين أن الكيمياء هو معدل الحد لك القط / K M لسلسلة polycyclization أجرته cyclases تريتيربيني 3. ومن الأهمية العالية للتحقق من درجة الحرارة الفعلية داخل قارورة زجاجية رد فعل مع الحرارة الخارجية. ومع ذلك، يمكن أن يناسب الخطية يكون الأكثر فقرا للمتغيرات مع ثابت أساسي ك واضح القط / القيم K M عند درجات حرارة مختلفة. وأكد هذا للالبديل S168F هنا (الشكل 2A) مع المحتوى الحراري تفعيل قريبة من الصفر (الشكل 2B و2C). األصغر جداتغييرات لتر درجة الحرارة التي تعتمد في الظاهر ك القط / K M، يمكن أن يفضي عدم اليقين في الكون تفعيل احظ Δ S ‡ (أي اعتراض في المؤامرات الخطية في الشكل 2B). من حيث المبدأ، ويمكن أيضا أن تتأثر تفعيل الكون المرصود من قبل وفرة مختلفة من الانزيمات النشطة للمتغيرات المختلفة، والتي لن يتم الكشف عن طريق قياس تركيز البروتين. ومن المتوقع أن الأخطاء التجريبية يتم تخفيض عند خلط عدة ركائز في بوتقة واحدة. وذلك لأن جميع ركائز مختلفة تتفاعل مع نفس كمية الانزيم في ظل هذه الظروف (المعادلة 4). استخدام مذيب استخراج ارتفع مع المعيار الداخلي هو المهم مراعاة الفروق أثناء استخراج و / أو GC-الحقن. وقد استخدم نظرية الحالة الانتقالية بنجاح في علم الإنزيمات 26. هذا الإطار النظري المهم كان دي أصلاveloped لردود الفعل unimolecular في الطور الغازي. ومع ذلك، فقد تبين أن الأنزيمات تعمل أساسا عن طريق خفض حاجز طاقة التنشيط الكلاسيكي 26. معامل انتقال يفترض أن تكون هنا يمكن للمرء أن يؤثر على المحتوى الحراري تفعيل قياس و / أو الكون. مساهمة نفق، وغيرها من الآثار غير التقليدية مثل recrossing الدولة تمر بمرحلة انتقالية، يمكن أن يسهم ما يقرب من 1000 أضعاف إلى 26 الحفز المقابلة لحوالي 4 كيلو كالوري / مول في مجال الطاقة. ويمكن ملاحظة أن الكون تفعيل عرض من النوع البري انزيم (16 كيلو كالوري / مول في 328 K، الشكل 2C) هو أكبر بكثير من هذه الآثار غير التقليدية الناجمة عن معامل انتقال غير موحدة. تأثير معامل انتقال يجب أن تنخفض عند المقارنة بين المعلمات الحرارية من التنشيط لنوع ونفق البرية المتغيرات باستخدام بروتوكول. طاقة جيبس الحرة للتنشيط (Δ G ‡) هو كومبوالحوار الاقتصادي الاستراتيجي من كل من enthalpic (Δ H ‡) والتدهور الحتمي (- T * Δ S ‡) المدى. إعادة تنظيم المذيبات في الإنزيمات خلال الحفز يمكن أن تؤثر في كل من المعلمات. ومن المتوقع أن تيسير دراسة هذه الظواهر عن طريق تجميع الأدوات من الأدوات الحاسوبية ذات الصلة وسهلة الاستعمال في سيليكون مع الإطار التجريبي الفيزيائية الحيوية اللازمة في هذا البروتوكول. ومن المتوقع طريقة لتكون مفيدة لدراسة عدد كبير من العمليات الأنزيمية، بما في ذلك الحفز بواسطة إنزيمات مرتبطة بالغشاء.

يشكل الماء حجر الزاوية للكيمياء الحياة 1. أنماط المياه واذابة من المواقع المفعلة انزيم تؤثر على كل من المحتوى الحراري والكون من يجند ملزم 1،2 و 3 الحفز بطريقة معقدة للغاية تتجاوز تأثير مسعور 2،3. NMR 4، الكالوري 2 والنمذجة الجزيئية للبروتينات الإذابة بالإكترونات تم استخدامها لتسليط الضوء على دور جزيئات الماء واضحة في توفير القوة الدافعة للجمعية يجند 5-8 والنوعية والنشاط 2،9،10. هنا نقدم منهجية فريدة من نوعها لتقييم تجريبي لأثر الترموديناميكيه النزوح المذيبات في إنزيم الحفز (الشكل 1). ويستند استراتيجيتنا مجتمعة على استخدام المحاكاة الحاسوبية بالتنسيق مع الهندسة انزيم وتحليل الترموديناميكيه (الشكل 1). وهذا يسمح لتسليط الضوء إضافيا على تأثير ديناميات المذيبات على نحو الأرضتحلل، والتي حاليا غير مفهومة. استقرار التفاعلات enthalpic، المقدمة من السندات الهيدروجين بوساطة المياه في المواقع المفعلة انزيم الإذابة بالإكترونات، يمكن أن يقابله العقوبات التدهور الحتمي 1. وترتبط هذه التكاليف التدهور الحتمي مع انخفاض في درجات الحرية المعروضة من قبل جزيئات المياه المحصورة داخل تجاويف البروتين، بالمقارنة مع المياه بكميات كبيرة 5. وبالتالي يمكن الافراج عن جزيئات الماء أمر توفير القوة الدافعة التدهور الحتمي للجمعية يجند 1 والحفز 3. أحد الجوانب الرئيسية لديناميات المذيبات هو النزوح من جزيئات الماء بين المناطق الداخلية من البروتينات ومذيب الخارجي 4. ليست مفهومة التغيرات المصاحبة في طاقة التنشيط، المحتوى الحراري، والكون 11 تماما على المستوى الجزيئي. عن طريق عرقلة الأنفاق الفردية المسؤولة عن نقل المياه في الإنزيمات، وأهمية ديناميات المذيبات ومساهمتها في تفعيلالطاقة يمكن تقييم (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، من خلال أداء وعاء واحد التجارب الحركية عند درجات حرارة مختلفة، ويمكن استخراج المعلمات تفعيل الثرموديناميكيه النسبية لعدة ركائز من عدد محدود من التجارب (الشكل 1، يمين). يتم التحقق من صحة منهجنا متعدد التخصصات لالمعقدة بغشاء الانزيمات تريتيربيني محلقة التي تولد تربين متعددة الحلقات ذات أهمية كبيرة للحياة 12. بروتوكول يسمح لاسترداد كميات عالية من البروتين غشاء (10-20 ملغ / L) باستخدام جهاز للطرد المركزي القياسية. على الرغم من الأنزيمات تطورت في الماء، وعادة ما أهملت دور المذيب في تعزيز الحفز. بالإضافة إلى ديناميات البروتين 13،14 هذا الشكل قبل تنظيم المواقع المفعلة مع التكامل الكهربائي إلى الحالة الانتقالية 15، يمكن أن ديناميات المياه تكون ذات أهمية عالية لكفاءة الحفز الانزيم. من خلال إقامة العديد من التقنيات متعددة التخصصات، لديناالهدف هو تسهيل دراسة معقدة للغاية من ديناميات المياه والديناميكا الحرارية. وجعل هذه الأدوات في متناول المجتمع العلمي يؤدي إلى تطوير استراتيجيات جديدة في الهندسة والتصميم انزيم البروتين للأنشطة المعدلة وخصوصياتها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1053">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">YASARA</td>
			<td style="width:148px;">YASARA Biosciences</td>
			<td style="width:173px;">http://www.yasara.org/</td>
			<td style="width:479px;">Molecular modeling and simulation program&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">CAVER&#160;</td>
			<td style="width:148px;">CaverSoft</td>
			<td style="width:173px;">http://caver.cz/</td>
			<td>Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Bradford Ultra</td>
			<td style="width:148px;">Expedeon</td>
			<td>BFU1L, BFU05L</td>
			<td>Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potter-Elvehjem homogenizer</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td>432-0205, 432-0217</td>
			<td>Homogenization of frozen cell pellet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer for sample incubation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling entropic rate acceleration induced by solvent dynamics in membrane enzymes

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.

هو متورط أهمية ديناميكية المياه في الأنزيمية polycyclization الحفز التي كتبها في تحليل سيليكون والتصور لاحق من الأنفاق الكشف عن (باستخدام البرنامج النصي في القانون التكميلي ملف 2). وعقب الباب 3 من البروتوكول، وجدت S168 لتكون &quot;هوت سبوت&quot; بقايا الأحماض الأمينية بطانة أحد الأنفاق في تريتيربيني محلقة الانزيم من Alicyclobacillus acidocaldarius (الشكل 1، وسط يسار). من خلال إدخال طفرة S168F في سيليكون، وعرقلة النفق كما رأينا عن طريق التفتيش البصري (الشكل 1، أسفل اليسار). معدل التفاعل لتشكيل المنتجات المتعددة الحلقات المعروضة بواسطة انزيم تريتيربيني محلقة حساس للغاية لدرجة الحرارة (الشكل 2A). بعد بروتوكول (القسم 4-7)، وتبين أن الظاهر ك القط / K <suب&gt; M المعروضة من قبل من النوع البري انزيم لتشكيل المنتجات خماسي يزيد خمسون طية عند رفع درجة الحرارة بمقدار 25 درجة مئوية (الشكل 2A). عرقلة الأنفاق الفردية عن طريق إدخال طفرة نقطة واحدة له تأثير كبير على المطلق ك واضح القط القيم تجريبيا / K M، فضلا عن درجة الحرارة اعتمادها (الشكل 2A). من المعلمات الحركية تجريبيا، يتم إنشاؤها المؤامرات الثرموديناميكيه الخطية المعادلة 3 والقسم 6-7 من بروتوكول للحركية الركيزة واحدة (الشكل 2B) التالية. التغيرات الكبيرة جدا في الكون التنشيط والمحتوى الحراري لوحظت في المتغيرات إيواء الأنفاق منعت تعني دورا رئيسيا لديناميكية المياه في الترويج لسلسلة polycyclization (الشكل 2C، الحسابات على أساس الشكل 2B). علاوة على ذلك، المتغيرات مع عرض أنفاق المياه المتغيرة لتغيير طاقة جيبس الحرة للتنشيط (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡، الشكل 2B-C). على سبيل المثال، في 303 K النفق البديل S168F يعرض طاقة جيبس ​​الحرة للتنشيط من 14 كيلو كالوري / مول مقابل 16 كيلو كالوري / مول للانزيم من النوع البري. بعد بروتوكول في الباب 7، المعادلة 4 يسمح لحساب القيم القط / K M ك واضحا للركائز إضافية من وعاء واحد التجارب الحركية (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، مؤامرة الحرارية الخطية (الشكل 3B) يمكن بناؤها عن طريق تشغيل مقال المنافسة عند درجات حرارة مختلفة (المعادلة 5). قياسا إلى حركية الركيزة واحدة، والمحتوى الحراري تفعيل النسبي والانتروبي للركائز إضافية مقابل مجمع الاشارة هي readilيمكن الوصول إليها من اعتراض والمنحدر من الخطية ذ يناسب البيانات التجريبية. يمكن تقييم القيم المطلقة للمعلمات الحرارية من التنشيط من إضافة الحسابية باستخدام البيانات الحرارية المرتبطة مجمع المرجعية (معادلة 6). باستخدام بروتوكول هنا، ولدت تظهر النتائج بوضوح أن انزيم الغشاء مع المتغيرات عرض أنفاق المياه منعت المعلمات الحرارية تختلف اختلافا جوهريا من تفعيل للركائز من أحجام مختلفة (الشكل 3C). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig1.jpg" /> الرقم ملخص بروتوكول 1.: في النمذجة الحاسوبية سيليكون وبالتنسيق مع تصميم تجريبي البروتين وتحليل الحرارية يسمح لفهم أفضل لتأثير ديناميات المذيبات على الحفز الانزيم <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر</a><html> هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig2.jpg" /> الشكل 2. الثيرموديناميكية تفعيل النوع البري ونفق المتغيرات من حركية الركيزة واحدة. (A) ك الظاهري القط / القيم K M تم الحصول عليها من البيانات التجريبية وباستخدام معادلات 1 و 2. (B) تحليل الترموديناميكيه باستخدام نظرية الحالة الانتقالية وتناسب خطية من البيانات التجريبية للمعادلة 3. (C) الثيرموديناميكية تفعيل تحسب من المؤامرات في (B). ويرد الركيزة السكوالين prefolded مع السندات شكلت / كسر كخطوط منقطة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig3.jpg" /> الرقم 3. المعايير الحرارية للتفعيل من النوع البري ونفق المتغيرات للركائز مختلفة. (A) ك النسبي القط / القيم K M تم الحصول عليها من حركية وعاء واحد باستخدام المعادلة 4. (B) المؤامرات الترموديناميكيه البيانات الحركية في مختلف درجات الحرارة باستخدام المعادلة 5. (C) معلمات الحرارية المطلقة التنشيط باستخدام المعادلة (6) وباستخدام السكوالين الركيزة في الشكل 2 كمرجع. يتم عرض السندات شكلت / كسر في ركائز كخطوط منقطة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes at JoVE.com

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

قنوات لنقل جزيئات الماء في أنزيمات تؤثر اذابة موقع نشط والحفز. هنا نقدم بروتوكول للهندسة هذه الدوافع التحفيزية إضافية استنادا في النمذجة الحاسوبية سيليكون والتجارب. وهذا يعزز فهمنا للتأثير ديناميات المذيبات في إنزيم الحفز.

كشف تسريع التدهور الحتمي أسعار المستحثة بواسطة المذيبات حيوية في غشاء الانزيمات

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Thermodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

تبريد أسعار التابعة القياسات Ellipsometry لتحديد ديناميات رقيقة زجاجية أفلام

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiolabeling والكمي لمستويات الخلايا من Phosphoinositides التي كتبها التلألؤ تدفق عالية الأداء اللوني السائل الديناميكي

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

حل الحيوي النووية الاستقطاب الأجهزة لفي الوقت الحقيقي القياسات الأنزيمية ردود الفعل قيم وNMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

المعاوقة الكهروكيميائية التحليل الطيفي كأداة لتقدير معدل الكهروكيميائية المستمر

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

تصنيع نانوكريستالس Micellar كروية وعلى شكل دودة من خلال الجمع بين اليكتروسبراي، التجميع الذاتي، ومراقبة الهيكل القائم على مذيب

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

الحمض النووي-المغناطيسي الجسيمات ربط التحليل بتشتت الضوء الديناميكي والغرواني الكهربي

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

تصور "ديناميات ليجنيفيكيشن" في النباتات مع "انقر فوق الكيمياء": "وسم المزدوج" هو النعيم!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

تصوير النانومترية من الأنيونات يتضح من 310 نانومتر مفرزة و−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Niobium Oxide Films Deposited by Reactive Sputtering: Effect of Oxygen Flow Rate

أفلام أكسيد النيوبيوم المودعة من قبل اخرق التفاعلية: تاثير معدل تدفق الأكسجين

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition ...

Vibrational Spectra of a N719-Chromophore/Titania Interface from Empirical-Potential Molecular-Dynamics Simulation, Solvated by a Room Temperature Ionic Liquid