Name: unraveling entropic rate acceleration induced by solvent dynamics in membrane enzymes
Uploaded: 2016-01-16T15:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes at JoVE.com

The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.

<ol>
	<li>Ball, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+as+an+active+constituent+in+cell+biology.">Water as an active constituent in cell biology.</a> Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).</li><li>Snyder, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+hydrophobic+effect+in+the+biomolecular+recognition+of+arylsulfonamides+by+carbonic+anhydrase.">Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).</li><li>Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+is+Key+to+the+Formation+of+Pentacyclic+Terpenoids+by+Enzyme-Catalyzed+Polycyclization.">Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).</li><li>Persson, F., Halle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Access+to+the+Protein+Interior:+Simulation+versus+NMR.">Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).</li><li>Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Active-Site+Solvent+in+the+Thermodynamics+of+Factor+Xa+Ligand+Binding.">Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).</li><li>Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Displacing+Water+Molecules+from+Protein+Binding+Sites:+Consequences+for+Ligand+Optimization.">Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).</li><li>Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+water+transfer+energy+to+protein-ligand+association+and+dissociation+barriers:+Watermap+analysis+of+a+series+of+p38&#206;&#177;+MAP+kinase+inhibitors.">Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38&#206;&#177; MAP kinase inhibitors.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).</li><li>Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motifs+for+molecular+recognition+exploiting+hydrophobic+enclosure+in+protein-ligand+binding.">Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).</li><li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-Mediated+Recognition+of+Simple+Alkyl+Chains+by+Heart-Type+Fatty-Acid-Binding+Protein.">Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).</li><li>Pavlova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesigning+dehalogenase+access+tunnels+as+a+strategy+for+degrading+an+anthropogenic+substrate.">Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).</li><li>Breiten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Networks+Contribute+to+Enthalpy/Entropy+Compensation+in+Protein-Ligand+Binding.">Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).</li><li>Oldfield, E., Lin, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terpene+biosynthesis:+Modularity+rules.">Terpene biosynthesis: Modularity rules.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 51 (5), 1124-1137 (2012).</li><li>Henzler-Wildman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+timescales+in+protein+dynamics+is+linked+to+enzyme+catalysis.">A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis.</a> Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).</li><li>Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+activity+regulation+by+conformational+entropy.">Protein activity regulation by conformational entropy.</a> Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+origin+of+the+catalytic+power+of+enzymes+and+the+role+of+preorganized+active+sites.">Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites.</a> J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).</li><li>Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+optimal+use+of+empirical+energy+functions:+Force-field+parameterization+in+crystal+space.">Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).</li><li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-charge+force+field+for+molecular+mechanics+simulations+of+proteins+based+on+condensed-phase+quantum+mechanical+calculations.">A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations.</a> J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).</li><li>Essmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smooth+particle+mesh+Ewald+method.">A smooth particle mesh Ewald method.</a> J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).</li><li>Chovancova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAVER+3.0:+a+tool+for+the+analysis+of+transport+pathways+in+dynamic+protein+structures.">CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures.</a> PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708 (2012).</li><li>Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+and+site-saturation+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol.</a> Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).</li><li>K&#252;rten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+functional+human+oxidosqualene+cyclase+in+Escherichia+coli.">Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli.</a> Protein Express. Purif. , (2015).</li><li>Eyring, H., Stearn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+theory+of+absolute+reaction+rates+to+proteins.">The application of the theory of absolute reaction rates to proteins.</a> Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+in+protein+science:+a+guide+to+enzyme+catalysis+and+protein.">Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein.</a> , (1999).</li><li>Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+squalene+cyclase.">Structure and function of a squalene cyclase.</a> Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+enzymes+work:+analysis+by+modern+rate+theory+and+computer+simulations.">How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations.</a> Science. 303 (5655), 186-195 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

जंगली प्रकार झिल्ली एंजाइम और सुरंग वेरिएंट के लिए उच्च गुणवत्ता प्रयोगात्मक thermodynamical डेटा प्राप्त करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: कंप्यूटर मॉडल का 1) पीढ़ी; 2) एक ही ढंग से शुद्ध प्रोटीन; 3) emulsified सब्सट्रेट शेयरों; 4) कैनेटीक्स के दौरान तापमान के नियंत्रण; आंतरिक मानक का उपयोग प्रतिक्रिया मिश्रण का 5) निष्कर्षण। कंप्यूटर मॉडल की पीढ़ी बहुत प्लेटफार्मों की एक किस्म का समर्थन करता है कि एक उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफेस के साथ एक सॉफ्टवेयर के उपयोग से मदद की है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल भी गैर विशेषज्ञों मॉडलिंग के लिए हमारी रणनीति सुलभ बनाने के लिए YASARA मॉडलिंग सूट 16 पर आधारित है। पानी सुरंग पहचान के लिए एक कंप्यूटर मॉडल आदर्श ब्याज 24 के एंजाइम की एक क्रिस्टल संरचना पर आधारित होना चाहिए। इस प्रयोजन के लिए प्रोटीन डेटा बैंक में उपलब्ध क्रिस्टल संरचनाओं के धन बहुत फायदेमंद है। हमारे अनुभव, मंदिर के सफल तैयार करने में एक महत्वपूर्ण पहलू मेंसुरंग की पहचान के लिए प्लेटों क्रिस्टेलोग्राफिक पानी रखने के लिए है। यह एक सामान्य कंप्यूटर पर चलाया जा सकता है जो आणविक गतिशीलता सिमुलेशन, जब प्रदर्शन एक solvated एंजाइम बॉक्स का उपयोग करने के लिए समान महत्व का है। Alicyclobacillus acidocaldarius से triterpene साइक्लेस एमडी सिमुलेशन 3 के दौरान पानी में स्थिर है। हालांकि, क्रिस्टेलोग्राफिक डिटर्जेंट रखने और / या कोशिका झिल्ली mimics का उपयोग कर शायद बढ़ाया एमडी सिमुलेशन के लिए अनुमति देने के लिए संभावित अस्थिर एंजाइमों के लिए आवश्यक होगा। यह इस सुरंग संगठन के dynamical पहलुओं पर कब्जा नहीं होगा, हालांकि अत्यधिक चुनौतीपूर्ण लक्ष्य का कम से कम क्रिस्टल संरचना, प्रोटोकॉल का उपयोग महत्वपूर्ण यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है कि कल्पना की है। एक या इनपुट के रूप में फोटो का एक सीमित संख्या के साथ बुनियादी मोड में caver 19, एक मानक लैपटॉप पर गैर-विशेषज्ञों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे अनुभव 3, एक टोंटी त्रिज्या के साथ सुरंगों (यानी, त्रिज्या के आधार परसबसे संकीर्ण बिंदु पर) की तुलना में छोटे 1 एक क्रिस्टेलोग्राफिक पानी के अणुओं बाएं मध्य), भविष्यवाणी की सुरंग (चित्रा 1 के भीतर रहते हैं, खासकर अगर पानी के लिए बेहद प्रासंगिक हो सकता है। दूसरी ओर, एक बड़ा टोंटी के दायरे में और सक्रिय साइट 10 में से सब्सट्रेट के परिवहन के लिए एक सुरंग के संकेत सकता है। अनुपूरक कोड में स्क्रिप्ट 2 भविष्यवाणी की सुरंगों के दृश्य के लिए गैर-विशेषज्ञों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता करें। भविष्य प्रयोगों अनुरूपता मॉडल पानी के नेटवर्क और गतिशीलता के atomistic अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च संकल्प का हो जाएगा कि क्या खोलेगा। साथ और सक्रिय साइट में मौजूद एक ligand के बिना, आणविक गतिशीलता सिमुलेशन प्रदर्शन करने के तरीके पर प्रकाश डालने वाली सुरंग पहचान की प्रक्रिया भी महत्व का होगा प्रभावित करती है। झिल्ली प्रोटीन की काइनेटिक्स एक दुर्जेय चुनौती 25 गठन कर सकते हैं। प्रोटोकॉल के साथ साथ एक सरल झिल्ली निकासी प्रोटोकॉल पर आधारित हैऐसे ultracentrifuge एक के रूप में महंगे उपकरण, के उपयोग के बिना झिल्ली एंजाइम प्राप्त करने के लिए। एक अंतिम चमकाने कदम के रूप में जेल निस्पंदन के उपयोग के संभावित अवशिष्ट झिल्ली कणों को हटा और एक उचित डिटर्जेंट पर्यावरण 25 को परिभाषित करने के लिए अनुमति देता है। प्रोटोकॉल से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गतिज परिणाम प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण पहलू ultrasonication द्वारा सब्सट्रेट शेयर समाधान पायसी करने के लिए है। प्रतिक्रिया बफर में पतला हाइड्रोफोबिक substrates के सरल vortexing inhomogeneous सब्सट्रेट-डिटर्जेंट मिश्रण देता है। गैर emulsified सब्सट्रेट समाधान के pipetting प्रारंभिक दरों का सही निर्धारण को रोकता है जो (मात्रात्मक जीसी द्वारा की पुष्टि की) irreproducible सांद्रता, की ओर जाता है। इसके विपरीत, ठीक से emulsified स्टॉक समाधान की pipetting 0.98-0.99 की सीमा में आर 2 के साथ प्रारंभिक दरों के रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण में परिणाम चाहिए। हाइड्रोफोबिक substrates के एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू स्पष्ट सब्सट्रेट घुलनशीलता हैऔर सब्सट्रेट-डिटर्जेंट मिश्रण में उपलब्धता। वास्तव में, यह संदर्भ सब्सट्रेट स्क्वैलिन साथ triterpene साइक्लेस तर करने के लिए संभव नहीं था। इस कारण स्पष्ट कश्मीर बिल्ली के लिए / कश्मीर एम मूल्यों दोनों बंधन और रसायन शास्त्र से योगदान को शामिल कर सकता है, जो इस के साथ साथ प्रस्तुत कर रहे हैं। हालांकि, यह रसायन शास्त्र कश्मीर बिल्ली के लिए दर सीमित है कि दिखाया गया है / triterpene cyclases 3 द्वारा आयोजित polycyclization झरना के लिए कश्मीर एम। यह एक बाहरी थर्मामीटर के साथ एक प्रतिक्रिया कांच की शीशी के अंदर वास्तविक तापमान सत्यापित करने के लिए उच्च महत्व का है। फिर भी, रेखीय फिट बैठता अलग तापमान पर आवश्यक निरंतर स्पष्ट कश्मीर बिल्ली / कश्मीर एम मूल्यों के साथ वेरिएंट के लिए गरीब हो सकते हैं। यह शून्य (चित्रा 2 बी और 2 सी) के करीब एक सक्रियण तापीय धारिता के साथ S168F संस्करण के साथ साथ (2A चित्रा) के लिए जोर दिया है। बहुत smalस्पष्ट कश्मीर बिल्ली में एल तापमान पर निर्भर परिवर्तन / कश्मीर एम मनाया सक्रियण एन्ट्रापी में अनिश्चितता उत्पन्न कर सकता Δ एस ‡ (यानी, चित्रा 2 बी में रैखिक भूखंडों में अवरोधन)। सिद्धांत रूप में, मनाया सक्रियण एन्ट्रापी भी प्रोटीन एकाग्रता को मापने के द्वारा पता लगाया जा नहीं होता है, जो अलग अलग वेरिएंट के लिए सक्रिय एंजाइम, का एक अलग बहुतायत से प्रभावित किया जा सकता है। यह एक बर्तन में कई substrates के मिश्रण जब प्रयोगात्मक त्रुटियों को कम कर रहे हैं कि उम्मीद है। सब अलग substrates इन परिस्थितियों में एंजाइम की एक ही राशि (समीकरण 4) के साथ बातचीत क्योंकि यह है। एक निष्कर्षण विलायक का प्रयोग आंतरिक मानक निकासी और / या जीसी इंजेक्शन के दौरान मतभेद के लिए खाते में करने के लिए महत्वपूर्ण है के साथ नुकीला। संक्रमण राज्य सिद्धांत को सफलतापूर्वक एंजाइमिकी 26 में इस्तेमाल किया गया है। यह महत्वपूर्ण सैद्धांतिक ढांचा मूलतः डे के गया थागैस चरण में unimolecular प्रतिक्रियाओं के लिए veloped। हालांकि, यह एंजाइमों मुख्य रूप से शास्त्रीय सक्रियण ऊर्जा बाधा 26 को कम करके काम है कि दिखाया गया है। एक के साथ साथ होना मान लिया संचरण गुणांक मापा सक्रियण तापीय धारिता और / या एन्ट्रापी प्रभावित कर सकता है। सुरंग खोदने का योगदान है, और इस तरह के संक्रमण राज्य recrossing के रूप में अन्य गैर शास्त्रीय प्रभाव, मोटे तौर पर ऊर्जा के क्षेत्र में लगभग 4 किलो कैलोरी / मोल के लिए इसी कटैलिसीस 26 को 1,000 गुना योगदान कर सकते हैं। यह (328 कश्मीर, चित्रा -2 में 16 किलो कैलोरी / मोल) जंगली प्रकार एंजाइम द्वारा प्रदर्शित सक्रियण एन्ट्रापी एक गैर वर्दी संचरण गुणांक की वजह से इस तरह के गैर-शास्त्रीय प्रभाव से भी बड़ा है कि देखा जा सकता है। प्रोटोकॉल का उपयोग जंगली प्रकार और सुरंग वेरिएंट के लिए सक्रियण की thermodynamic पैरामीटर की तुलना करते समय संचरण गुणांक के प्रभाव को कम करना चाहिए। सक्रियण की गिब्स मुक्त ऊर्जा (Δ जी ‡) कम्पो हैएक enthalpic (Δ एच ‡) और एक entropic दोनों की एसईडी (- टी * Δ एस ‡) शब्द। कटैलिसीस के दौरान एंजाइमों में विलायक पुनर्गठन दोनों मानकों को प्रभावित कर सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल आवश्यक biophysical प्रयोगात्मक ढांचे के साथ प्रासंगिक और सिलिको में उपयोगकर्ता के अनुकूल कम्प्यूटेशनल उपकरण का एक साधन कोडांतरण द्वारा इन घटनाओं के अध्ययन की सुविधा होने की उम्मीद है। विधि झिल्ली ही सीमित एंजाइमों द्वारा कटैलिसीस सहित एंजाइमी प्रक्रियाओं, की अधिकता के अध्ययन के लिए उपयोगी होने की परिकल्पना की गई है।

जल जीवन एक के रसायन विज्ञान के लिए एक आधार का गठन किया। जल पैटर्न और एंजाइम सक्रिय साइटों की solvation तापीय धारिता और हाइड्रोफोबिक प्रभाव 2,3 परे का विस्तार एक अत्यधिक जटिल फैशन में 1,2 और कटैलिसीस 3 बाध्यकारी ligand के एन्ट्रापी दोनों प्रभावित करते हैं। एनएमआर 4, उष्मामिति 2 और solvated प्रोटीन की आणविक मॉडलिंग ligand के सहयोग से 5-8, विशिष्टता और गतिविधि 2,9,10 के लिए एक प्रेरणा शक्ति प्रदान करने में स्पष्ट पानी के अणुओं की भूमिका पर प्रकाश डाला करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस के साथ साथ हम एंजाइम कटैलिसीस पर विलायक विस्थापन की thermodynamical प्रभाव (चित्रा 1) की प्रायोगिक मूल्यांकन के लिए एक अनोखी पद्धति प्रस्तुत करते हैं। हमारा संयुक्त रणनीति एंजाइम इंजीनियरिंग और thermodynamical विश्लेषण (चित्रा 1) के साथ मिलकर कंप्यूटर सिमुलेशन का उपयोग पर आधारित है। इस CATA पर विलायक गतिशीलता के प्रभाव पर अतिरिक्त प्रकाश बहा के लिए अनुमति देता हैवर्तमान में खराब समझा जाता है, जो सेल,। Solvated एंजाइम सक्रिय साइटों में पानी की मध्यस्थता हाइड्रोजन बांड द्वारा प्रदान की enthalpic बातचीत, स्थिर, entropic दंड 1 की भरपाई की जा सकती है। थोक 5 में पानी की तुलना में ये entropic लागत, प्रोटीन गुहाओं के भीतर ही सीमित पानी के अणुओं द्वारा प्रदर्शित स्वतंत्रता की डिग्री में कमी के साथ जुड़े रहे हैं। आदेश दिया पानी के अणुओं की रिहाई इस प्रकार ligand के सहयोग से 1 और कटैलिसीस 3 के लिए एक entropic प्रेरणा शक्ति प्रदान कर सकते हैं। विलायक गतिशीलता का एक महत्वपूर्ण पहलू प्रोटीन की आंतरिक और बाहरी विलायक 4 के बीच पानी के अणुओं का विस्थापन है। सक्रियण ऊर्जा, तापीय धारिता, और एन्ट्रापी 11 में साथ पूरी तरह से बदल आणविक स्तर पर समझ नहीं रहे हैं। सक्रियण एंजाइमों में पानी के परिवहन, विलायक गतिशीलता के महत्व और उसके योगदान के लिए जिम्मेदार व्यक्ति को सुरंगों में बाधा डालने के द्वाराऊर्जा (चित्रा 1) का मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके अलावा, अलग तापमान पर एक बर्तन गतिज प्रयोगों के प्रदर्शन से, कई substrates के रिश्तेदार thermodynamical सक्रियण मापदंडों के प्रयोगों की एक कम संख्या (चित्रा 1, दाएं) से निकाला जा सकता है। हमारे अंतःविषय विधि जीवन 12 के लिए उच्च महत्व के पॉलीसाइक्लिक terpenes उत्पन्न कि जटिल झिल्ली ही सीमित triterpene साइक्लेस एंजाइमों के लिए मान्य है। प्रोटोकॉल एक मानक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर झिल्ली प्रोटीन की उच्च मात्रा (10-20 मिलीग्राम / एल) की वसूली के लिए अनुमति देता है। एंजाइमों पानी में विकसित किया है, कटैलिसीस को बढ़ावा देने में विलायक की भूमिका आमतौर पर उपेक्षित है। आकार संक्रमण राज्य से 15 इलेक्ट्रोस्टैटिक पूरकता के साथ सक्रिय साइटों पूर्व संगठित कि प्रोटीन गतिशीलता 13,14 के अलावा, पानी की गतिशीलता कुशल एंजाइम कटैलिसीस के लिए उच्च महत्व का हो सकता है। कई अंतःविषय तकनीक बनाकर हमारेउद्देश्य पानी की गतिशीलता और ऊष्मा के अत्यधिक जटिल अध्ययन की सुविधा के लिए है। वैज्ञानिक समुदाय के लिए इन उपकरणों का अधिक सुलभ बनाने बदल गतिविधियों और विशिष्टताओं के लिए एंजाइम इंजीनियरिंग और प्रोटीन डिजाइन में नई रणनीति के विकास को बढ़ावा मिलेगा।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1053">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">YASARA</td>
			<td style="width:148px;">YASARA Biosciences</td>
			<td style="width:173px;">http://www.yasara.org/</td>
			<td style="width:479px;">Molecular modeling and simulation program&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">CAVER&#160;</td>
			<td style="width:148px;">CaverSoft</td>
			<td style="width:173px;">http://caver.cz/</td>
			<td>Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Bradford Ultra</td>
			<td style="width:148px;">Expedeon</td>
			<td>BFU1L, BFU05L</td>
			<td>Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potter-Elvehjem homogenizer</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td>432-0205, 432-0217</td>
			<td>Homogenization of frozen cell pellet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer for sample incubation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling entropic rate acceleration induced by solvent dynamics in membrane enzymes

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.

एंजाइमी polycyclization कटैलिसीस में पानी की गतिशीलता के महत्व सिलिको विश्लेषण और पता लगाया सुरंगों के बाद के दृश्य में (2 फ़ाइल अनुपूरक कोड में स्क्रिप्ट का उपयोग) से फंसा है। प्रोटोकॉल की धारा 3 के बाद, S168 Alicyclobacillus acidocaldarius से triterpene साइक्लेस एंजाइम में सुरंगों में से एक अस्तर एक &quot;गर्म स्थान&quot; अमीनो एसिड अवशेषों (चित्रा 1, बाएं मध्य) हो पाया है। दृश्य निरीक्षण (चित्रा 1, नीचे बाएँ) के रूप में देखा सिलिको में उत्परिवर्तन S168F को शुरू करके, सुरंग बाधित है। triterpene साइक्लेस एंजाइम द्वारा प्रदर्शित पॉलीसाइक्लिक उत्पादों के गठन के लिए प्रतिक्रिया की दर तापमान (2A चित्रा) के लिए बेहद संवेदनशील है। प्रोटोकॉल (धारा 4-7) के बाद, यह पाया जाता है स्पष्ट कश्मीर बिल्ली / कश्मीर कि <suतापमान 25 डिग्री सेल्सियस (2A चित्रा) द्वारा उठाया जाता है जब b&gt; pentacyclic उत्पादों के गठन के लिए जंगली प्रकार एंजाइम द्वारा प्रदर्शित एम fiftyfold बढ़ जाती है। एक बिंदु उत्परिवर्तन शुरू करने से व्यक्ति सुरंगों को अवरूध्द प्रयोगात्मक निर्धारित निरपेक्ष स्पष्ट कश्मीर बिल्ली / कश्मीर एम मूल्यों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है, साथ ही उनके तापमान निर्भरता (2A चित्रा) पर। प्रयोगात्मक निर्धारित गतिज मापदंडों से, रैखिक thermodynamical भूखंडों समीकरण 3 से और एकल सब्सट्रेट कैनेटीक्स (चित्रा 2 बी) के लिए प्रोटोकॉल की धारा 6-7 निम्न द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। अवरुद्ध सुरंगों को शरण देने वेरिएंट के लिए मनाया सक्रियण एन्ट्रापी और तापीय धारिता में बहुत बड़े परिवर्तन (चित्रा 2 बी के आधार पर चित्रा -2 सी, गणना) एक प्रमुख polycyclization झरना को बढ़ावा देने में पानी की गतिशीलता के लिए भूमिका निकलता है। अतिरिक्तबदल पानी सुरंगों सक्रियण का बदला हुआ गिब्स मुक्त ऊर्जा प्रदर्शन के साथ, वेरिएंट (Δ जी ‡ = Δ एच ‡ - टी * Δ एस ‡, चित्रा 2 बी-सी)। उदाहरण के लिए, 303 कश्मीर में S168F सुरंग संस्करण जंगली प्रकार एंजाइम के लिए 16 किलो कैलोरी / मोल की तुलना में 14 किलो कैलोरी / मोल की सक्रियता का एक गिब्स मुक्त ऊर्जा को प्रदर्शित करता है। धारा 7 में प्रोटोकॉल के बाद, समीकरण 4 एक पॉट गतिज प्रयोगों से अतिरिक्त substrates (चित्रा 3) के लिए स्पष्ट कश्मीर बिल्ली / कश्मीर एम मूल्यों की गणना के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, एक रेखीय thermodynamic साजिश (3B चित्रा) अलग तापमान (समीकरण 5) में प्रतियोगिता निबंध चलाकर निर्माण किया जा सकता है। एकल सब्सट्रेट कैनेटीक्स को सादृश्य में, एक संदर्भ यौगिक की तुलना में अतिरिक्त substrates के लिए रिश्तेदार सक्रियण तापीय धारिता और एन्ट्रापी readil हैंरेखीय के अवरोधन और ढलान से सुलभ Y प्रयोगात्मक डेटा के लिए फिट बैठता है। सक्रियण के thermodynamic मापदंडों के निरपेक्ष मूल्यों के संदर्भ में यौगिक (समीकरण 6) के साथ जुड़े thermodynamic के डेटा का उपयोग करके अंकगणित अलावा से मूल्यांकन किया जा सकता है। इस के साथ साथ प्रोटोकॉल का उपयोग करना, परिणाम स्पष्ट रूप से अवरुद्ध पानी सुरंगों विभिन्न आकारों (चित्रा 3 सी) के substrates के लिए सक्रियण के मौलिक रूप से अलग thermodynamic पैरामीटर प्रदर्शन के साथ झिल्ली एंजाइम वेरिएंट पता चलता है कि उत्पन्न। <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig1.jpg" /> चित्रा 1. प्रोटोकॉल सारांश:। प्रयोगात्मक प्रोटीन डिजाइन और thermodynamic विश्लेषण के साथ संगीत कार्यक्रम में सिलिको कंप्यूटर मॉडलिंग में एंजाइम कटैलिसीस पर विलायक गतिशीलता के प्रभाव के एक बढ़ाया समझ के लिए अनुमति देता <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig1large.jpg" target="_blank">क्लिक करें</a>यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए। <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig2.jpg" /> एकल सब्सट्रेट कैनेटीक्स से जंगली प्रकार और सुरंग वेरिएंट की सक्रियता का आंकड़ा 2 thermodynamic पैरामीटर। (ए) स्पष्ट कश्मीर बिल्ली / प्रयोगात्मक डेटा से और संक्रमण राज्य सिद्धांत का उपयोग कर समीकरणों 1 और 2 (बी) thermodynamical विश्लेषण का उपयोग करके प्राप्त कश्मीर एम मूल्यों और प्रयोगात्मक डेटा के रैखिक फिट (बी) में भूखंडों से गणना की सक्रियता का 3. (सी) thermodynamic पैरामीटर समीकरण के लिए। prefolded स्क्वैलिन सब्सट्रेट बांड के साथ दिखाया गया है का गठन / बिंदीदार लाइनों के रूप में टूटी हुई है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig2large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> विभिन्न substrates के लिए जंगली प्रकार और सुरंग वेरिएंट की सक्रियता का चित्रा 3. thermodynamic पैरामीटर। (ए) सापेक्ष कश्मीर बिल्ली / समीकरण 4. (बी) का उपयोग करके एक बर्तन कैनेटीक्स से प्राप्त कश्मीर एम मूल्यों अलग से गतिज डेटा की thermodynamical भूखंडों समीकरण 5. (सी) समीकरण 6 से और संदर्भ के रूप में चित्रा 2 में सब्सट्रेट स्क्वैलिन का उपयोग करके गणना की सक्रियता का निरपेक्ष thermodynamic के मापदंडों का उपयोग तापमान। का गठन / substrates में टूट बांड बिंदीदार लाइनों के रूप में दिखाया गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig3large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes at JoVE.com

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

एंजाइमों में पानी के अणुओं के परिवहन के लिए चैनल सक्रिय साइट solvation और कटैलिसीस प्रभावित करते हैं। इस के साथ साथ हम सिलिको कंप्यूटर मॉडलिंग और प्रयोगों के आधार पर इन अतिरिक्त उत्प्रेरक रूपांकनों के इंजीनियरिंग के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस एंजाइम कटैलिसीस पर विलायक गतिशीलता के प्रभाव के बारे में हमारी समझ में वृद्धि होगी।

झिल्ली एंजाइमों में विलायक डायनेमिक्स द्वारा प्रेरित Unraveling Entropic दर त्वरण

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Thermodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

दर निर्भर ellipsometry माप शीतलक पतला ग्लासी फिल्म्स की गतिशीलता निर्धारित करने के लिए

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर प्रवाह जगमगाहट से radiolabeling और Phosphoinositides की सेलुलर स्तर की मात्रा

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

विघटन गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण एनएमआर द्वारा वास्तविक समय enzymatic प्रतिक्रिया दर माप के लिए उपकरण

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

विद्युत दर लगातार अनुमान के लिए एक उपकरण के रूप में विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

Electrospray, स्व-विधानसभा, और विलायक आधारित संरचना नियंत्रण के संयोजन से गोलाकार और कृमि के आकार का Micellar Nanocrystals का निर्माण

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

डीएनए-चुंबकीय कण गतिशील और Electrophoretic प्रकाश कैटरिंग द्वारा बाध्यकारी विश्लेषण

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

क्लिक रसायन विज्ञान के साथ पौधों में Lignification गतिशीलता visualizing: दोहरी लेबलिंग आनंद है!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

F− की ३१० एनएम टुकड़ी द्वारा सचित्र ॠणायन की Photoelectron इमेजिंग

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Niobium Oxide Films Deposited by Reactive Sputtering: Effect of Oxygen Flow Rate

Niobium ऑक्साइड फिल्म्स प्रतिक्रियाशील sputtering द्वारा जमा: ऑक्सीजन प्रवाह दर का प्रभाव

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition ...

Vibrational Spectra of a N719-Chromophore/Titania Interface from Empirical-Potential Molecular-Dynamics Simulation, Solvated by a Room Temperature Ionic Liquid