Name: unraveling entropic rate acceleration induced by solvent dynamics in membrane enzymes
Uploaded: 2016-01-16T15:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes at JoVE.com

The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.

<ol>
	<li>Ball, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+as+an+active+constituent+in+cell+biology.">Water as an active constituent in cell biology.</a> Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).</li><li>Snyder, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+hydrophobic+effect+in+the+biomolecular+recognition+of+arylsulfonamides+by+carbonic+anhydrase.">Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).</li><li>Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+is+Key+to+the+Formation+of+Pentacyclic+Terpenoids+by+Enzyme-Catalyzed+Polycyclization.">Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).</li><li>Persson, F., Halle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Access+to+the+Protein+Interior:+Simulation+versus+NMR.">Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).</li><li>Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Active-Site+Solvent+in+the+Thermodynamics+of+Factor+Xa+Ligand+Binding.">Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).</li><li>Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Displacing+Water+Molecules+from+Protein+Binding+Sites:+Consequences+for+Ligand+Optimization.">Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).</li><li>Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+water+transfer+energy+to+protein-ligand+association+and+dissociation+barriers:+Watermap+analysis+of+a+series+of+p38&#206;&#177;+MAP+kinase+inhibitors.">Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38&#206;&#177; MAP kinase inhibitors.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).</li><li>Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motifs+for+molecular+recognition+exploiting+hydrophobic+enclosure+in+protein-ligand+binding.">Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).</li><li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-Mediated+Recognition+of+Simple+Alkyl+Chains+by+Heart-Type+Fatty-Acid-Binding+Protein.">Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).</li><li>Pavlova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesigning+dehalogenase+access+tunnels+as+a+strategy+for+degrading+an+anthropogenic+substrate.">Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).</li><li>Breiten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Networks+Contribute+to+Enthalpy/Entropy+Compensation+in+Protein-Ligand+Binding.">Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).</li><li>Oldfield, E., Lin, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terpene+biosynthesis:+Modularity+rules.">Terpene biosynthesis: Modularity rules.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 51 (5), 1124-1137 (2012).</li><li>Henzler-Wildman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+timescales+in+protein+dynamics+is+linked+to+enzyme+catalysis.">A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis.</a> Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).</li><li>Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+activity+regulation+by+conformational+entropy.">Protein activity regulation by conformational entropy.</a> Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+origin+of+the+catalytic+power+of+enzymes+and+the+role+of+preorganized+active+sites.">Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites.</a> J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).</li><li>Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+optimal+use+of+empirical+energy+functions:+Force-field+parameterization+in+crystal+space.">Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).</li><li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-charge+force+field+for+molecular+mechanics+simulations+of+proteins+based+on+condensed-phase+quantum+mechanical+calculations.">A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations.</a> J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).</li><li>Essmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smooth+particle+mesh+Ewald+method.">A smooth particle mesh Ewald method.</a> J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).</li><li>Chovancova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAVER+3.0:+a+tool+for+the+analysis+of+transport+pathways+in+dynamic+protein+structures.">CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures.</a> PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708 (2012).</li><li>Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+and+site-saturation+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol.</a> Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).</li><li>K&#252;rten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+functional+human+oxidosqualene+cyclase+in+Escherichia+coli.">Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli.</a> Protein Express. Purif. , (2015).</li><li>Eyring, H., Stearn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+theory+of+absolute+reaction+rates+to+proteins.">The application of the theory of absolute reaction rates to proteins.</a> Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+in+protein+science:+a+guide+to+enzyme+catalysis+and+protein.">Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein.</a> , (1999).</li><li>Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+squalene+cyclase.">Structure and function of a squalene cyclase.</a> Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+enzymes+work:+analysis+by+modern+rate+theory+and+computer+simulations.">How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations.</a> Science. 303 (5655), 186-195 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Наиболее важные шаги в достижении высокого качества экспериментальных термодинамических данных для дикого типа мембраны ферментов и туннельных вариантов: 1) генерация компьютерной модели; 2) равномерно очищенные белки; 3) эмульсию запасы субстрата; 4) контроль температуры во время кинетики; 5) добыча реакционных смесей с использованием внутреннего стандарта. Поколение компьютерной модели значительно облегчается при использовании программного обеспечения с дружественным интерфейсом, который поддерживает различные платформы. Следовательно, этот протокол основывается на YASARA Modeling Suite 16, чтобы наша стратегия доступна даже к моделированию неспециалистов. Компьютерная модель для идентификации вода туннеля в идеале должна быть основана на кристаллической структуре интерес фермента 24. Для этой цели богатый кристаллическими структурами доступны в банке данных белков является очень полезным. По нашему опыту, ключевой аспект в успешной подготовке ТЕАПластины для идентификации туннеля, чтобы сохранить кристаллографических воды. Это не менее важно, чтобы использовать сольватированную фермента окно при выполнении молекулярного моделирования динамики, которые могут быть запущены на обычный компьютер. Тритерпеновые циклаза от Alicyclobacillus acidocaldarius стабилен в воде в течение МД 3. Тем не менее, сохраняя кристаллографических моющие средства и / или с использованием клеточной мембраны имитирует бы, возможно, потребуется для потенциально нестабильных ферментов, чтобы в течение длительного МД. Предполагается, что минимизируется кристаллическая структура высоко сложных целей может предоставить важную механистическую представление с использованием протокола, хотя это не будет захватывать динамических аспектов туннельного организации. Спелеолог 19 в базовом режиме, с одной или ограниченного числа снимков в качестве вклада, могут быть использованы неспециалистами на стандартном ноутбуке. Основываясь на нашем опыте 3, тоннелей с радиусом узкого (т.е., радиусна самом узком месте) меньше, чем 1 А может быть весьма актуальны для воды, особенно если кристаллографические молекулы воды находятся в пределах предсказанного туннеля (рис 1, средний левый). С другой стороны, больший радиус узким может означать туннель для транспортировки подложки в и из активного сайта 10. Сценарий в дополнительном файле кода 2 может быть использован лицами, не являющимися специалистами для визуализации предсказанных туннелей. Дальнейшие эксперименты покажут, будет ли модели гомологии быть достаточно высоким разрешением, чтобы позволить атомистической исследования водных сетей и динамики. Пролить свет на выполнении моделирования молекулярной динамики, с и без лиганда в активном центре, влияет на процесс идентификации туннеля будет иметь значение также. Кинетика мембранных белков может представлять собой сложную задачу 25. Протокол в данном документе основана на протоколе экстракции простым мембраныдля получения мембранного фермента без использования дорогостоящего оборудования, такого как ультрацентрифуге. Применение гель-фильтрации в качестве конечной стадии полировки удаляет частицы остаточного потенциальных мембраны и обеспечивает определении соответствующей среды моющего 25. Ключевым аспектом в достижении воспроизводимые результаты кинетических от протокола является эмульсию субстрата маточного раствора ультразвуком. Простой вортексе гидрофобных субстратов разбавленных в реакционном буфере дает неоднородные субстрат-моющих смесей. Пипетирующем не-эмульгированных решений субстрата приводит к невоспроизводимых концентрациях (подтвержденных количественного GC), что предотвращает точное определение начальных ставок. В противоположность этому, пипетки надлежащим эмульгированных растворов должно привести к линейной регрессии начальных скоростей с R 2 в диапазоне 0.98-0.99. Еще один важный аспект гидрофобных субстратов является очевидным растворимость субстратаи наличие в субстрат-моющих смесей. На самом деле, это не было возможно, чтобы насытить тритерпеновых циклазу со ссылкой подложки сквалена. По этой причине очевидно, К кот / значения К М представлены здесь, которые могут содержать вклады от обоих связывания и химии. Тем не менее, было показано, что химия ограничение скорости для к кошке / К М для polycyclization каскада, проведенного тритерпеновых циклаз 3. Это имеет большое значение для проверки фактической температуры внутри реакция стеклянном флаконе с внешним термометром. Тем не менее, линейные подходит может быть беднее для вариантов с необходимым постоянных очевидно K CAT / значений К м при различных температурах. Это подчеркнуто для варианта S168F в данном документе (фиг.2А) с энтальпией активации, близкой к нулю (рис 2В и 2С). Очень Смальл в зависимости от температуры изменения в видимой К кошки / К М, может вызвать неопределенность в наблюдаемой энтропии активации Δ S ‡ (т.е. перехват в линейных участков на рисунке 2B). В принципе, наблюдаемый энтропии активации может также зависеть от другого обилие активных ферментов для различных вариантов, которые не будут обнаружены путем измерения концентрации белка. Ожидается, что экспериментальные ошибки уменьшаются при смешивании несколько подложек в одном горшке. Это потому, что все различные субстраты взаимодействуют с таким же количеством фермента в этих условиях (уравнение 4). Использование экстракционным растворителем с шипами внутренний стандарт важно для учета различий в процессе экстракции и / или GC-инъекции. Государственная теория Переход был успешно использован в энзимологии 26. Это важное теоретическое основа была изначально детых для мономолекулярных реакций в газовой фазе. Тем не менее, было показано, что ферменты в основном работают за счет снижения классического активации энергетический барьер 26. Коэффициент передачи считать один насто щем описании может повлиять на измеряемую энтальпии активации и / или энтропии. Вклад туннелирования, и другие неклассические эффекты, такие как повторного пересечения переходного состояния, может способствовать примерно в 1000 раз катализа 26 соответствует примерно 4 ккал / моль энергии. Видно, что энтропия активации отображается на ферментом дикого типа (16 ккал / моль при 328 К, рис 2С) гораздо больше, чем таких неклассических эффектов, вызванных неоднородным коэффициентом пропускания. Влияние коэффициента передачи должна уменьшаться при сравнении термодинамических параметров активации для дикого типа и туннельных вариантов, использующих протокол. Свободная энергия Гиббса активации (Δ G ‡) является компоSed обоих в энтальпической (Δ H ‡) и энтропийных (- Т * Δ S ‡) срок. Растворитель реорганизация ферментов во катализа может влиять на оба параметра. Настоящий Протокол, как ожидается, облегчить изучение этих явлений путем сборки соответствующих инструментов и удобный в кремнии вычислительных средств с необходимой биофизической экспериментальной базы. Способ предусмотрено полезными при изучении множество ферментативных процессов, в том числе катализе мембраносвязанных ферментов.

Вода является краеугольным камнем для химии жизни 1. Водные узоры и сольватации ферментных активных сайтах влиять как на энтальпии и энтропии связывания лиганда 1,2 и катализ 3 в весьма сложным образом, выходящих за пределы гидрофобного эффекта 2,3. ЯМР 4, 2 и калориметрии молекулярное моделирование белков сольватированными были использованы, чтобы пролить свет на роль явных молекул воды в предоставлении движущей силой для лиганда ассоциации 5-8, специфичности и активности 2,9,10. В этом мы представляем уникальную методику для экспериментальной оценки термодинамической воздействия перемещения растворителя на ферментативного катализа (рис 1). Наша объединенная стратегия основана на использовании компьютерного моделирования совместно с ферментом техники и термодинамического анализа (рисунок 1). Это позволяет пролить дополнительный свет на воздействие динамики растворителя на CATAлизис, который в настоящее время мало изучены. Стабилизация энтальпической взаимодействия, предусмотренные воды опосредованной водородных связей в сольватированы ферментных активных сайтах, может быть компенсировано энтропийных штрафов 1. Эти энтропийные затраты связаны с уменьшением степени свободы, отображаемого молекул воды заключены в белковых полостей, по сравнению с водой в объеме 5. Релиз молекул воды могут упорядоченных таким образом, обеспечить энтропийную движущую силу для лиганда ассоциации 1 и катализа 3. Одним из ключевых аспектов динамики растворитель представляет собой смещение молекул воды между внутренней и белков внешней растворителя 4. Прилагаемые изменения в энергии активации, энтальпия, энтропия и 11 полностью не поняты на молекулярном уровне. По воспрепятствование отдельные тоннели, ответственных за транспорт воды в ферментов, значение динамики растворителей и его вклад в активациюэнергия может быть оценена (рисунок 1). Кроме того, путем выполнения в одном реакторе кинетические опыты при разных температурах, относительные термодинамические параметры активации нескольких подложек могут быть извлечены из уменьшенного количества экспериментов (фиг.1, справа). Наша междисциплинарная метод утверждена для сложных мембраносвязанных ферментов тритерпеновый циклазу, которые генерируют полициклические терпены высокой важности для жизни 12. Протокол позволяет для восстановления больших количеств белка (мембраны 10-20 мг / л) с использованием стандартного центрифуги. Хотя ферменты развивались в воде, роль растворителя в продвижении катализ, как правило, пренебрегают. В дополнение к динамике белка 13,14, что форма предварительно организованных активных сайтов с электростатическим взаимодополняемости в переходном состоянии 15, динамика воды может быть большое значение для эффективного ферментативного катализа. По ковки несколько междисциплинарных методов, нашЦель заключается в содействии весьма комплексное изучение динамики водных и термодинамики. Внесение этих инструменты более доступными для научного сообщества приведет к разработке новых стратегий в фермента инженерии и белкового дизайна для измененных деятельности и специфики.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1053">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">YASARA</td>
			<td style="width:148px;">YASARA Biosciences</td>
			<td style="width:173px;">http://www.yasara.org/</td>
			<td style="width:479px;">Molecular modeling and simulation program&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">CAVER&#160;</td>
			<td style="width:148px;">CaverSoft</td>
			<td style="width:173px;">http://caver.cz/</td>
			<td>Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Bradford Ultra</td>
			<td style="width:148px;">Expedeon</td>
			<td>BFU1L, BFU05L</td>
			<td>Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potter-Elvehjem homogenizer</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td>432-0205, 432-0217</td>
			<td>Homogenization of frozen cell pellet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer for sample incubation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling entropic rate acceleration induced by solvent dynamics in membrane enzymes

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.

Важность динамики вод в ферментативной polycyclization катализа вовлечен в анализ по силикомарганца и последующей визуализации обнаруженных туннелей (с помощью скрипта в дополнительном файле кода 2). После раздела 3 протокола, S168 оказывается остаток &quot;горячей точкой&quot; аминокислота подкладка один из туннелей в тритерпенового циклазы фермента из Alicyclobacillus acidocaldarius (Рисунок 1, средний левый). Вводя мутации S168F в кремнии, тоннель мешает, как видно при визуальном осмотре (рис 1, нижняя левая). Скорость реакции для образования продуктов полициклических отображаемых тритерпеновых циклазы фермента очень чувствителен к температуре (фиг.2А). После протокола (раздел 4-7), он обнаружил, что на кажущуюся к CAT / K <suB&gt; М отображается фермента дикого типа для формирования пентациклических продуктов увеличивает пятидесятикратном при повышении температуры от 25 ° С (фиг.2А). Блокирование отдельных туннелей путем введения единого точечную мутацию оказывает существенное влияние на экспериментально определенных значений абсолютной / очевидными к кошачьих К М, а также на их температурной зависимости (фиг.2А). Из экспериментально определенных кинетических параметров, линейные термодинамические участки создаются с помощью уравнения 3 и следующем разделе 6-7 протокола для одиноких кинетики субстрата (рис 2b). Очень большие изменения энтропии и энтальпии активации наблюдаемые для вариантов несущих заблокированные туннели подразумевает ключевую роль в динамике вод в продвижении polycyclization каскад (рис 2С, расчеты на основе рис 2B). более того, Варианты с измененными тоннели воды отображать измененный свободной энергии Гиббса активации (Δ G = Δ ‡ ‡ Н - Т * Δ S ‡, 2В-С). Например, при 303 K туннель вариант S168F отображает свободную энергию Гиббса активации 14 ккал / моль по сравнению с 16 ккал / моль для фермента дикого типа. После протокола в разделе 7, уравнение 4 позволяет для расчета CAT / значений очевидно K K M для дополнительных субстратов из одного горшка кинетических экспериментов (рис 3а). Кроме того, линейный участок термодинамического (3В) могут быть построены путем запуска конкурса эссе при различных температурах (уравнение 5). По аналогии с одиночными кинетики субстрата, относительная энтальпия активации и энтропии в дополнительных субстратов по сравнению с эталонной соединения являются readilу добраться от перехвата и наклон линейной подходит для экспериментальных данных. Абсолютные значения термодинамических параметров активации может быть оценена из арифметического сложения с помощью термодинамических данных, связанных с эталонного соединения (уравнение 6). Использование протокола в данном описании, генерируется результаты ясно показывают, что мембрана фермент варианты с заблокированные туннели воды отображать принципиально разные термодинамические параметры активации для подложек разных размеров (рис 3C). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig1.jpg" /> Рисунок 1. Протокол Резюме:. В силикомарганца компьютерного моделирования в концерте с экспериментального проектирования белка и термодинамического анализа позволяет более глубокое понимание влияния растворителей на динамике ферментативного катализа <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите</a>здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig2.jpg" /> Рисунок 2. Термодинамические параметры активации вариантов дикого типа и туннельных из одиночных кинетики субстрата. (A) Полная K кошка / значения К М, полученные из экспериментальных данных и с помощью уравнений 1 и 2 (B) Термодинамический анализ с использованием теории переходного состояния и линейной аппроксимации экспериментальных данных уравнения 3. (C) термодинамические параметры активации, рассчитанные из участков в (В). Сложенные сквален субстрат показано с облигациями сформирован / сломана пунктирными линиями. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> Фигура 3. термодинамические параметры активации вариантов дикого типа и туннель для различных подложках. (А) относительно K кат / К М значения, полученные из одного горшка кинетики путем использования уравнения 4. (B) Термодинамические участки кинетических данных на разные температура использованием уравнения 5. (C) Абсолютная термодинамические параметры активации, рассчитанные по уравнению 6, и с использованием подложки сквален на рисунке 2 в качестве ссылки. Облигации формируется / разбивал субстратов показаны пунктирными линиями. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes at JoVE.com

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Каналы для транспортировки молекул воды в ферментов влиять активное сольватацию сайта и катализ. В этом мы приводим протокол для техники этих дополнительных каталитических мотивов, основанных на в силикомарганца компьютерного моделирования и экспериментов. Это позволит повысить наше понимание влияния динамики растворителя на ферментативного катализа.

Раскрытие Энтропическое Оценить ускорение, растворителем Dynamics в мембранных ферментов

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Thermodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

Охлаждение скоростью, зависящей эллипсометрии измерений для определения динамики тонких пленок стеклообразных

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Радиоактивной и Количественная клеточном уровнях фосфоинозитидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании-Flow мерцаний

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Растворение динамическая поляризация ядер Инструментарий в реальном времени ферментативной реакции Стоимость Измерения с помощью ЯМР

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Электрохимический импеданс спектроскопия как инструмент для электрохимических скорость постоянной оценки

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

Изготовление сферических и червь образный мицеллярный нанокристаллов путем объединения электроспрей, самостоятельной сборки и на основе растворителей структуры управления

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

ДНК-магнитопорошковый обязательного анализа динамических и электрофоретической рассеяние света

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Визуализация Lignification динамика в растениях с нажмите химия: двойная маркировка, БЛАЖЕНСТВО!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

Фотоэлектронная изображений анионов, иллюстрируется 310 Нм отряд F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Niobium Oxide Films Deposited by Reactive Sputtering: Effect of Oxygen Flow Rate

Ниобий оксида Пленки депонируется реактивного распыления: Влияние скорости кислородного потока

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition ...

Vibrational Spectra of a N719-Chromophore/Titania Interface from Empirical-Potential Molecular-Dynamics Simulation, Solvated by a Room Temperature Ionic Liquid

Вибрационная спектра N719-Хромофор/Титания Интерфейс от Эмпирического-Потенциального Молекулябельно-динамического моделирования, соваренного ионной жидкостью комнатной температуры