Name: unraveling entropic rate acceleration induced by solvent dynamics in membrane enzymes
Uploaded: 2016-01-16T15:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes at JoVE.com

The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.

1. I Silico datormodellering <ol><li> Ladda ner ett preliminärt budgetförslag strukturen av proteinet av intresse från banken proteindata (PBF). Förbered struktur genom att ta bort överflödiga subenheter och sedan lägga saknade väteatomer och explicit lösningsmedel med hjälp av &quot;Cell Oskadligöring och p K en förutsägelse&quot; experiment i YASARA 16. För membranbundna triterpene cyclases lämpliga dimensioner vattenbehållaren är 91x67x77 Å. Justera protonetillstånd de katalytiskt aktiva aminosyrorna manuellt. Obs: Om det behövs, kan ett substrat analog i det preliminära budgetförslaget filen ändras till ett verkligt substrat genom att använda &quot;Redigera | Swap | Atom&quot; kommandot. </li><li> Minimera strukturen av &quot;energiminimering&quot; kommandot med hjälp av AMBER kraftfält suite 17. Använd partikel mesh Ewald strategi (PME) 18 redogöra för långväga elektrostatiska interaktioner. Ställ avskärningen för van der Waals växelverkningar enligttill standardinställningar. Obs! &quot;Energiminimering&quot; -kommandot bort konforma stress genom en kort brantaste härkomst minimering, sedan en simulerad glödgning (tidssteg 2 fsec, atomhastigheter skalas ned med 0,9 var 10: e steg) utföres tills konvergens uppnås (dvs. förbättring av energi med mindre än 0,012 kcal / mol per atom under 200 steg). </li></ol> 2. Modell av Active Site Solvatisering och Vatten Tillgång <ol><li> Efter den simulerade glödgning, kör en 20 NSEC molekyldynamik (MD) bana och generera minst 10 bilder från &quot;Arkiv | Spara som | Simulering Snapshot&quot; kommando följt av &quot;Simulation On&quot;. Kör simuleringarna på en vanlig dator med periodiska randvillkor enligt den kanoniska ensemblen. Hålla temperaturen vid 298 K med hjälp av en Berendsen termostat. </li><li> Förbered ögonblicksbilder som erhålls från 2,1 genom att ta bort alla vattenmolekyler och eventuella ligander / substrat med hjälp av4; Redigera | Ta bort | Rest &quot;kommandot överlagra varje stillbild individuellt på den ursprungliga preliminära budgetförslaget-strukturen av.&quot; Överlagra | Object &quot;för att se till att alla strukturer delar samma rumsliga positionen Spara varje stillbild framställd på detta sätt som en ny preliminära budgetförslaget. -file (metoden &quot;Arkiv | Spara som | PBF&quot; kommando). Obs: För erfarna modellbyggare: Skriv ett manus för att automatisera processen enligt mallen anges i Tilläggskodex-fil 1. </li><li> Använd de förberedda snapshots (PBF) från 2,2 som har anpassats i 3D-rymden som insignaler till programvaran caver 3,0 19. För analys av ett begränsat antal bilder, köra Caver på en vanlig dator. Använd en sondradie av 0,7 Å 19 för att säkerställa detektion av tunnlar som är specifika för transport av vattenmolekyler. </li><li> Visualisera tunnlarna genereras av Caver 3,0 i en molekylgrafikprogram. För enkel visualisering av tunnlar, använd makro visas i Tilläggskodex File 2. </li></ol> 3. I Silico Enzyme Engineering att Ändra Vatten Mönster och vatten Dynamics <ol><li> Identifiera de högst rankade tunnlarna enligt rubriken &quot;ID&quot; som anges i utdatafilen &quot;Summary.txt&quot; genereras från 3,0 programvaran Caver. </li><li> Identifiera aminosyror som kantar de högst rankade tunnlar (3,1) och att bildskärmen en liten sidokedja pekar mot kanal inre genom visuell inspektion (enligt den modell som erhålls från 2,4). Identifiera enskilda aminosyrasubstitutioner som kommer att blockera tunneln genom ökad sterisk hind använda &quot;swap Återstod&quot; -kommandot. Verifiera att tunneln hindras genom visuell inspektion, och därefter genom att upprepa steg 1,2-3,1 i protokollet. </li></ol> 4. Redovisning av muterade gener <ol><li> Introducera mutationer i vildtyp-genen genom mutagenes-PCR med användning av icke-överlappande primrar 20. </li><li> Lägg plasmid-DNA innehållande genen av intresse till rörets med kompetenta celler av en lämplig kloningsstam och inkubera på is under 30 minuter. Utför en värmechocks transformation för 45 sekunder i ett vattenbad med temperaturen inställd på 42 ° C. Tillsätt 500 | il av en färsk rikt medium (2YT, 16 g / I trypton, 10 g / I jästextrakt, 5 g / L NaCI) och inkubera vid 37 ° C, 200 rpm under 45 minuter. Göra ett val genom utstrykning av transformerade cellerna på agarplattor kompletterade med lämpliga antibiotika. </li><li> Efter verifiering av DNA-sekvensen för den muterade genen, transformera plasmid DNA i en expressionsstam med användning värmechock, såsom beskrivits ovan. För uttryck av membranbundna triterpene cyclases använder BL21 (DE3). </li><li> Starta en 5 ml O / N-kulturen vid 37 ° C av expressionsstammen i 2YT-medium kompletterat med lämpliga antibiotika. </li><li> Ympa en 2 L bafflad skakflaska, innehållande 300 ml 2YT-medium kompletterat med lämpliga antibiotika, till en slutlig OD av 0,05-0,09 (mätt vid 600 nm). Efter induktion vid en OD av 0,6-0.8 och proteinuttryck, frysa cellpelleten och förvara vid -80 ° C. <ol><li> För membranbundna triterpene cyclases i en pD861 vektor, inducera med 0,5-2 mM ramnos och 4 h av expression vid 37 ° C för att uppnå höga utbyten av protein 21. </li></ol></li></ol> 5. Membran Extraction med en vanlig centrifug och Protein Purification <ol><li> Bered följande buffertar: resuspensionsbuffert (100 mM kaliumfosfat, pH 7,5 kompletterad med proteashämmare tabletter), detergentbuffert (1% (volym / volym) Triton X-100, 50 mM kaliumfosfat, pH 7,5) och reaktionsbuffert (0,2 % Triton X-100, 50 mM kaliumfosfat, pH 7,5). <ol><li> För skvalen-hopene cyclases eller andra membranbundna enzymer med lägre pH-optimum, byt kaliumfosfat i resuspensionsbuffert med citrat. För sådana enzymer använda följande buffertar: detergentbuffert (1% Triton X-100, 60 mM citrat, pH 6,0) och reaktionsbuffert (0,2% Triton-X 100, 60 mM citrat, pH 6,0). Obs: Om en His-taggen används för rening, komplettera resuspensionsbuffert med 20 mM imidazol (slutlig koncentration). </li></ol></li><li> Väg en frusen cellpellet i en glasbägare. Resuspendera cellerna i resuspensionsbuffert med användning av en homogenisator till en slutkoncentration av 0,3 g celler / ml. Lysera resuspenderade cellerna genom ultrasonikering med en amplitud av 80% och en puls av en sekund på och en sekund av. Använd tre upprepade cykler av 50 sekunder vardera. </li><li> Lägg detergentbuffert till en slutkoncentration av 0,2% (volym / volym) rengöringsmedel. Jämvikt genom end-over-end blandning vid 4 ° C under 1 timme. Återvinna membranproteinfraktionen genom att spara supernatanten efter en enda centrifugeringssteg vid 39 tusen xg under 50 min vid 4 ° C. Obs: Om His-tag-rening används, tillsätt ca 1,5 ml Ni-NTA-agaros / g celler och inkubera i 1 timme. </li><li> Utför en första reningssteg antingen jonbyte eller His-tag rening 21. Komplettera jämvikts och elueringsbuffertar med 0,2% Triton X-100. Koncentrera det renade proteinet fem gånger med användning av centrifugalfilter Enheter med en cut-off av 10 kDa. Obs: Storleken av Triton X-100 miceller resulterar i en koncentration av detergent till en slutkoncentration av ca 1%. </li><li> Färdigställa rening genom en gelfiltrering poleringssteg med användning av den koncentrerade protein och ett matris kompatibel med ett fraktioneringsområde för globulära proteiner av 2 x 10 4 -8 × 10 6. Använd reaktionsbufferten som löpbufferten. Mäta mängden renat protein genom användning av Bradford Ultra kit enligt tillverkarens protokoll. </li></ol> 6. Kinetik <ol><li> Gör en färsk 5 mM stamlösning av substrat i reaktionsbuffert. Skaffa en homogen emulsion genom ultraljudsbehandling vid 30% amplitud under 2-5 minuter. </li><li> Jämvikta en Thermomixervid den önskade reaktionstemperaturen. Verifiera temperaturen inuti en glasflaska innehållande vatten genom en extern termometer. </li><li> För enkelsubstrat kinetik, späd den emulgerade substratet till åtminstone fem glasvialer till samma slutliga substratkoncentrationen. <ol><li> För en-potten relativa kinetik med flera substrat, förbereda minst fem identiska glasflaskor genom att blanda alla underlag i varje flaska. För hydrofoba triterpener, använda slutliga substratkoncentrationer inom området från 10 till 200 | iM. </li></ol></li><li> Preinkubera glasflaskorna i Thermomixer under 10 min. Starta reaktionen genom tillsats av enzymet. En total reaktionsvolym av 1 ml är lämpliga. Använd en skakande hastighet av minst 1200 rpm. </li><li> Stoppa reaktionerna vid olika tidpunkter genom att tillsätta 500 l etylacetat spetsat med 100 iM dekanol som ett integrations standard. </li></ol> 7. Extraktion och termodynamiska analys <ol><li> Extrahera reaktionsblandningarna frånvirvling och manuell skakning av glasflaskor om kraftigt under 1 minut. Centrifugera glasflaskor vid 9600 xg i en bordscentrifug under 10 min vid RT. Överför det översta lagret (organisk fas) till ett tomt rör. Lägg ytterligare 500 pl av extraktionslösningsmedlet till reaktionsrören och upprepa extraktionsmetod. </li><li> Torka de extraherade reaktionsblandningar med Na 2 SO 4. Vortexa i 5 sek och låta rören vila i 10 minuter. Utför en slutlig centrifugeringssteg vid 9600 xg under 1 min vid RT med användning av en bordscentrifug. Överför de extraherade proven till gaskromatografi (GC) injektionsflaskor. </li><li> Upprepa stegen under 6,1-7,2 för varje enzymvariant av intresse, med användning av minst fyra olika initiala koncentrationen av substratet (för enstaka substrat kinetik) och fyra olika temperaturer (för både enda substrat och konkurrenskraftiga kinetik). </li><li> Utför GC-analys som tidigare beskrivits 3. Använd en icke-polär kolonn för analys av hydrophobIC pentacyclic produkter. Ställ den initiala ugnstemperaturen till 120 ° C och använda en temperaturgradient av 5 ° C / min, beroende på de produkter och kolonnen. </li><li> Integrera toppytorna av produkt (er) och omvandla produkttoppareorna till de motsvarande produktkoncentrationer genom att utnyttja den del av integrationsstandard (motsvarande 100 | iM). Plotta koncentrationen av varje produkt ([P]) som funktion av reaktionstiden (t). Utför linjär regression av de datapunkter som motsvarar mindre än 10% omvandling. Den initiala reaktionshastigheten (V 0) ges av lutningen av den anpassade linjen enligt: <img alt="Ekvation 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation1.jpg" /> Anmärkning: För en-pot relativa kinetik med flera substrat, V 0 är den initiala hastigheten av ett särskilt substrat under inflytande av andra substrat. </li><li> För enskilda substrat kinetik, tomt V 0 </sub&gt; / [E] mot motsvarande substratkoncentrationer. Den skenbara kcat / M-värdet ges av lutningen hos den linjära delen av grafen enligt: <img alt="Ekvation 2" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation2.jpg" /> [S] är koncentrationen av substrat och [E] koncentrationen av enzym som användes vid transformationen. Kcat / M är lika med den katalytiska konstant över Michaelis konstant. Upprepa analysen för varje temperatur och varje enzymvariant. </li><li> För enskilda substrat kinetik, utföra en termodynamisk analys enligt övergångsteori 22 <img alt="Ekvation 3" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation3.jpg" /> k b är Boltzmanns konstant, h Plancks konstant, T är temperaturen i Kelvin, och R gaskonstanten. Utför en linjär regressionsanalys av handlingen i ln ((k <sub&gt; cat / Km) / ((k-b * T) / h))) som funktion av 1 / T. Aktiverings entalpi (Δ H ‡) ges av (-Lutning) * R och aktiverings entropi (Δ S ‡) ges av (intercept) * R. Obs: På samma sätt kan en analys enligt mättsubstratkoncentration utföras med k katt som hastighetskonstant i ekvation 3. </li><li> För en-potten relativa kinetik med flera substrat, få den relativa sken kcat / M-värden från 23: (Kcat / Km) A / (kcat / KM) B = V 0, A / V-0, B * [B] / [A] (4) där V 0 hänvisar A till den ursprungliga satsen för substrat A i konkurrens med substrat B. </li><li> För ett kärl relativt kinetics med flera substrat, få de relativa termodynamiska parametrar för aktivering av B, jämfört med A som referens, genom icke-linjär regression: <img alt="Ekvation 5" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation5.jpg" /></li><li> Beräkna absoluta aktiveringsparametrarna för substrat B från aktiverings entalpi och entropi referens förening A: <img alt="Ekvation 6" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation6.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Ball, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+as+an+active+constituent+in+cell+biology.">Water as an active constituent in cell biology.</a> Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).</li><li>Snyder, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+hydrophobic+effect+in+the+biomolecular+recognition+of+arylsulfonamides+by+carbonic+anhydrase.">Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).</li><li>Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+is+Key+to+the+Formation+of+Pentacyclic+Terpenoids+by+Enzyme-Catalyzed+Polycyclization.">Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).</li><li>Persson, F., Halle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Access+to+the+Protein+Interior:+Simulation+versus+NMR.">Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).</li><li>Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Active-Site+Solvent+in+the+Thermodynamics+of+Factor+Xa+Ligand+Binding.">Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).</li><li>Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Displacing+Water+Molecules+from+Protein+Binding+Sites:+Consequences+for+Ligand+Optimization.">Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).</li><li>Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+water+transfer+energy+to+protein-ligand+association+and+dissociation+barriers:+Watermap+analysis+of+a+series+of+p38&#206;&#177;+MAP+kinase+inhibitors.">Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38&#206;&#177; MAP kinase inhibitors.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).</li><li>Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motifs+for+molecular+recognition+exploiting+hydrophobic+enclosure+in+protein-ligand+binding.">Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).</li><li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-Mediated+Recognition+of+Simple+Alkyl+Chains+by+Heart-Type+Fatty-Acid-Binding+Protein.">Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).</li><li>Pavlova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesigning+dehalogenase+access+tunnels+as+a+strategy+for+degrading+an+anthropogenic+substrate.">Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).</li><li>Breiten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Networks+Contribute+to+Enthalpy/Entropy+Compensation+in+Protein-Ligand+Binding.">Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).</li><li>Oldfield, E., Lin, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terpene+biosynthesis:+Modularity+rules.">Terpene biosynthesis: Modularity rules.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 51 (5), 1124-1137 (2012).</li><li>Henzler-Wildman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+timescales+in+protein+dynamics+is+linked+to+enzyme+catalysis.">A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis.</a> Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).</li><li>Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+activity+regulation+by+conformational+entropy.">Protein activity regulation by conformational entropy.</a> Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+origin+of+the+catalytic+power+of+enzymes+and+the+role+of+preorganized+active+sites.">Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites.</a> J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).</li><li>Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+optimal+use+of+empirical+energy+functions:+Force-field+parameterization+in+crystal+space.">Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).</li><li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-charge+force+field+for+molecular+mechanics+simulations+of+proteins+based+on+condensed-phase+quantum+mechanical+calculations.">A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations.</a> J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).</li><li>Essmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smooth+particle+mesh+Ewald+method.">A smooth particle mesh Ewald method.</a> J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).</li><li>Chovancova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAVER+3.0:+a+tool+for+the+analysis+of+transport+pathways+in+dynamic+protein+structures.">CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures.</a> PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708 (2012).</li><li>Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+and+site-saturation+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol.</a> Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).</li><li>K&#252;rten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+functional+human+oxidosqualene+cyclase+in+Escherichia+coli.">Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli.</a> Protein Express. Purif. , (2015).</li><li>Eyring, H., Stearn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+theory+of+absolute+reaction+rates+to+proteins.">The application of the theory of absolute reaction rates to proteins.</a> Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+in+protein+science:+a+guide+to+enzyme+catalysis+and+protein.">Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein.</a> , (1999).</li><li>Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+squalene+cyclase.">Structure and function of a squalene cyclase.</a> Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+enzymes+work:+analysis+by+modern+rate+theory+and+computer+simulations.">How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations.</a> Science. 303 (5655), 186-195 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

De mest kritiska stegen i att uppnå hög kvalitet experimentella termodynamiska data för vildtyp membranenzym och tunnel varianter är: 1) generation av datormodell; 2) homogent renade proteiner; 3) emulgerade substratlager; 4) kontroll av temperaturen under kinetik; 5) utvinning av reaktionsblandningar med hjälp av intern standard. Genereringen av datormodellen i hög grad underlättas genom användningen av en programvara med ett användarvänligt gränssnitt som stöder en mängd olika plattformar. Därför är detta protokoll nämnas först på YASARA modellering suite 16 för att göra vår strategi tillgänglig även för modellering icke-experter. En datormodell för vattentunnel identifiering bör helst baseras på en kristallstruktur av enzymet av intresse 24. För detta ändamål, är mycket fördelaktigt den rikedom av kristallstrukturer som finns i proteindatabank. I vår erfarenhet, en viktig aspekt i den framgångsrika framställningen av templattor för tunnelidentifiering är att hålla kristallo vatten. Det är lika viktigt att använda en solvatiserad enzym ruta när du utför molekyldynamiksimuleringar, som kan köras på en vanlig dator. Triterpene cyklas från Alicyclobacillus acidocaldarius är stabilt i vatten under MD simuleringar 3. Men att hålla kristallo detergenter och / eller genom att använda cellmembran härmar kanske skulle krävas för potentiellt instabila enzymer för att medge under utsträckta MD simuleringar. Det är tänkt att den minimerade kristallstrukturen av mycket utmanande mål kan ge viktiga mekanistiska insikter med hjälp av protokollet, även om detta inte skulle fånga dynamiska aspekterna av tunnel organisation. Caver 19 i grundläget, med en enda eller ett begränsat antal bilder som indata, kan användas av icke-experter på en vanlig bärbar dator. Baserat på vår erfarenhet 3, tunnlar med en flaskhals radie (dvs. radienvid den smalaste punkten) mindre än 1 Å kan vara mycket relevant för vatten, särskilt om kristallovattenmolekyler uppehålla sig inom den förutsagda tunneln (Figur 1, mitten till vänster). Å andra sidan kan en större flaskhals radie medför en tunnel för transport av substratet i och ut ur det aktiva stället 10. Skriptet i Tilläggskodex File 2 kan användas av icke-experter för visualisering av förväntade tunnlar. Framtida experiment kommer att avslöja om homologi modeller kommer att vara tillräckligt hög upplösning för att möjliggöra atomistisk studie av vattennätverk och dynamik. Belysa hur utför molekyldynamiksimuleringar, med och utan en ligand närvarande i det aktiva stället, påverkar processen för tunneln identifiering skulle också vara av betydelse. Kinetics av membranproteiner kan utgöra en väldig utmaning 25. Protokollet är baserad på en enkel membran extraktion protokollatt erhålla membranenzym utan användning av dyrbar utrustning, såsom en ultracentrifug. Användningen av gelfiltrering såsom en slutlig polering avlägsnar potentiella resterande membranpartiklar och möjliggör för att definiera en lämplig tvättmedel miljö 25. En viktig aspekt för att uppnå reproducerbara kinetiska resultat från protokollet är att emulgera substratstamlösning genom ultraljuds. Enkel virvling av hydrofoba substrat utspädda i reaktionsbufferten ger inhomogena blandningar substrattvättmedels. Den pipettering av icke-emulgerade substratlösningar leder till reproducerbara koncentrationer (bekräftas av kvantitativ GC), vilket förhindrar noggrann bestämning av initiala priser. Däremot bör pipettering av korrekt emulgerade stamlösningar resultera i linjär regressionsanalys av initiala priser med R 2 i området av 0,98 till 0,99. En annan viktig aspekt av hydrofoba substrat är den skenbara substratet löslighetenoch tillgänglighet i blandningarna substrattvättmedels. I själva verket var det inte möjligt att mätta triterpenen cyklas med referenssubstrat skvalen. Av detta skäl framgår kcat / M-värden presenteras häri, vilka kan innehålla bidrag från både bindning och kemi. Det har emellertid visats att kemin är hastighetsbegränsande för kcat / Km för polycyclization kaskaden som utförs av triterpene cyclases 3. Det är mycket viktigt att kontrollera den faktiska temperaturen inuti en reaktionsglasflaska med en extern termometer. Ändå kan linjära passar vara sämre för varianter med essentiell konstant uppenbara k cat / K M-värden vid olika temperaturer. Detta betonas för S168F varianten häri (Figur 2A) med en aktiverings entalpi nära noll (figur 2B och 2C). Mycket small temperaturberoende förändringar i uppenbar k cat / K M, kan ge upphov till osäkerhet i observerade aktiverings entropi Δ S ‡ (dvs skärningen i de linjära tomter i figur 2B). I princip skulle den observerade aktiverings entropi också påverkas av en annan förekomst av aktiva enzymer för olika varianter, som inte skulle upptäckas genom att mäta proteinkoncentrationen. Det förväntas att experimentella fel reduceras vid blandning flera substrat i en kruka. Detta beror på att alla de olika substraten växelverkar med samma mängd enzym under dessa förhållanden (ekvation 4). Användningen av ett extraktionslösningsmedel spetsat med en intern standard är viktigt att ta hänsyn till skillnader under extraktion och / eller GC-injektion. Övergångstillstånds teori har med framgång använts i enzymologi 26. Denna viktiga teoretiska ramverk ursprungligen frånutvecklats för unimolekylära reaktioner i gasfasen. Det har emellertid visats att enzymerna fungerar huvudsakligen genom att sänka den klassiska aktiveringsenergibarriären 26. Transmissionskoefficienten antas vara ett dokument kan påverka den uppmätta aktiverings entalpi och / eller entropi. Bidraget från tunneldrivning, och andra icke-klassiska effekter såsom återkorsning av övergångstillståndet, kan grovt bidra 1000-faldigt till katalys 26 motsvarande ca 4 kcal / mol i energi. Det kan ses att aktiverings entropin visas av vildtypsenzymet (16 kcal / mol vid 328 K, figur 2C) är mycket större än sådana icke-klassiska effekter som orsakas av en ojämn transmissionsfaktorn. Effekterna av transmissionskoefficienten ska minska när man jämför termodynamiska parametrar för aktivering för vildtyp och tunnel varianter som använder protokollet. Gibbs fria energi för aktivering (Δ G ‡) är kompoSED både en enthalpic (Δ H ‡) och en entropisk (- T * Δ S ‡) sikt. Lösningsmedel omorganisation enzymer under katalys kan påverka båda parametrarna. Den nuvarande protokollet väntas underlätta studier av dessa fenomen genom att samla en verktygslåda av relevanta och användarvänliga in silico beräkningsverktyg med nödvändig biofysiska experimentell ram. Metoden är tänkt att vara användbara för att studera en mängd enzymatiska processer, inklusive katalys av membranbundna enzymer.

Vatten utgör en hörnsten för livets kemi 1. Vattenmönster och solvatisering av enzym aktiva ställen påverkar både entalpin och entropi av ligandbindning 1,2 och katalys 3 på ett mycket komplext sätt som sträcker sig bortom den hydrofoba effekten 2,3. NMR 4, kalorimetri 2 och molekylär modellering av lösta proteiner har använts för att belysa betydelsen av explicita vattenmolekyler för att ge en drivkraft för ligand förening 5-8, specificitet och aktivitet 2,9,10. Häri presenterar vi en unik metod för experimentell bedömning av termodynamiska effekter förskjutning lösningsmedel på enzymkatalys (Figur 1). Vår samlade strategin bygger på att använda datorsimuleringar i samförstånd med enzymteknik och termodynamisk analys (Figur 1). Detta gör det möjligt att kasta ytterligare ljus över effekterna av lösningsmedels dynamik på catalys, som för närvarande är dåligt förstådd. Stabiliserande enthalpic interaktioner, som tillhandahålls av vatten medierad vätebindningar i solvatiserad enzym aktiva ställen, kan kompenseras genom entropiska straff 1. Dessa entropiska kostnader i samband med minskning av frihetsgrader visas av vattenmolekyler begränsade inom protein håligheter, jämfört med vatten i bulk 5. Frisläppandet av beställda vattenmolekyler kan därmed ge en entropisk drivkraft för ligand förening 1 och katalys 3. En viktig aspekt av lösningsmedels dynamik är förskjutningen av vattenmolekyler mellan det inre av proteiner och det yttre lösningsmedlet 4. De medföljande förändringar i aktiveringsenergi, entalpi och entropi 11 är inte klarlagd på molekylär nivå. Genom att hindra enskilda tunnlar som är ansvariga för transport av vatten i enzymer, vikten av lösningsmedels dynamik och dess bidrag till aktiveringsenergi kan utvärderas (Figur 1). Dessutom, genom att utföra en pott kinetiska experiment vid olika temperaturer, de relativa termodynamiska aktiveringsparametrarna för flera substrat kan utvinnas ur ett minskat antal experiment (figur 1, höger). Vår tvärvetenskapliga metod är validerad för komplexa membranbundna triterpen cyklas enzymer som genererar polycykliska terpener av stor betydelse för livet 12. Protokollet möjliggör återvinning av höga mängder av membranprotein (10-20 mg / L) med användning av en standardcentrifug. Även enzymer utvecklades i vatten, är den roll av lösningsmedlet för att främja katalys vanligtvis försummas. Förutom proteindynamik 13,14 som formar förväg organiserade aktiva platser med elektro komplement till övergångstillståndet 15, kan vattendynamik vara av stor betydelse för effektiv enzymkatalys. Genom smidning flera tvärvetenskapliga metoder, vårSyftet är att underlätta den mycket komplexa studie av vattendynamik och termodynamik. Att göra dessa verktyg mer tillgängliga för forskarvärlden kommer att leda till utveckling av nya strategier i enzymteknik och proteindesign för förändrade aktiviteter och särdrag.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1053">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">YASARA</td>
			<td style="width:148px;">YASARA Biosciences</td>
			<td style="width:173px;">http://www.yasara.org/</td>
			<td style="width:479px;">Molecular modeling and simulation program&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">CAVER&#160;</td>
			<td style="width:148px;">CaverSoft</td>
			<td style="width:173px;">http://caver.cz/</td>
			<td>Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Bradford Ultra</td>
			<td style="width:148px;">Expedeon</td>
			<td>BFU1L, BFU05L</td>
			<td>Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potter-Elvehjem homogenizer</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td>432-0205, 432-0217</td>
			<td>Homogenization of frozen cell pellet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer for sample incubation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling entropic rate acceleration induced by solvent dynamics in membrane enzymes

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.

Vikten av vatten dynamiken i enzymatisk polycyclization katalys är inblandad med in silico analys och efterföljande visualisering av upptäckta tunnlar (med hjälp av skriptet i Tilläggskodex File 2). Efter avsnitt 3 i protokollet, är S168 visar sig vara en &quot;hot spot&quot; aminosyrarest foder en av tunnlarna i triterpene cyklas enzymet från Alicyclobacillus acidocaldarius (Figur 1, mitten till vänster). Genom att införa mutationen S168F in silico är tunneln hindras sett genom visuell inspektion (Figur 1, nere till vänster). Reaktionshastigheten för bildning av polycykliska produkter visas av triterpen cyklasenzymet är mycket känslig för temperaturen (Figur 2A). Att följa protokollet (avsnitt 4-7), har det visat sig att den skenbara kcat / <sub&gt; M visas av vildtypsenzymet för bildandet av pentacykliska produkterna ökar fiftyfold när temperaturen höjs med 25 ° C (Figur 2A). Blockering enskilda tunnlar genom att införa en enda punktmutation har en betydande inverkan på de experimentellt bestämda absoluta uppenbara k cat / K M-värden, samt deras temperaturberoende (figur 2A). Från experimentellt bestämda kinetiska parametrar, är linjära termodynamiska tomter som genereras av ekvation 3 och genom att följa avsnitt 6-7 i protokollet för enstaka substrat kinetik (Figur 2B). De mycket stora förändringar i aktiverings entropi och entalpi observeras för varianter hyser blockerade tunnlar innebär en viktig roll för vattendynamik för att främja polycyclization kaskad (Figur 2C, beräkningar baserade på figur 2B). Dessutom, Varianter med förändrade vattentunnlar visar en förändrad Gibbs fria energi för aktivering (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡, figur 2B-C). Till exempel, vid 303 K är S168F tunneln varianten visas en Gibbs fria energi för aktivering av 14 kcal / mol jämfört med 16 kcal / mol för vildtypsenzymet. Efter protokollet i avsnitt 7, ekvation 4 gör det möjligt att beräkna uppenbara k cat / K M värden för ytterligare substrat från en pott kinetiska experiment (figur 3A). Dessutom kan en linjär termodynamisk kurva (Figur 3B) konstrueras genom att köra tävlingen uppsats vid olika temperaturer (ekvation 5). I analogi med enda substrat kinetik, den relativa aktiverings entalpi och entropi för ytterligare substrat jämfört med en referenssammansättning är readily nås från skärnings och lutningen på den linjära passar i experimentdata. Absoluta värden av termodynamiska parametrar för aktivering kan bedömas ur aritmetiska tillägg genom att använda termodynamiska data som är associerade med referensföreningen (ekvation 6). Med hjälp av protokollet häri, givit resultat visar tydligt att membranenzymvarianter med blockerade vattentunnlar visar fundamentalt olika termodynamiska parametrar för aktivering för substrat i olika storlekar (Figur 3C). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig1.jpg" /> Figur 1. Protokoll Sammanfattning:. In silico datamodeller i samförstånd med experimentell proteindesign och termodynamisk analys möjliggör en ökad förståelse av påverkan av lösningsmedel dynamik på enzymkatalys <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig1large.jpg" target="_blank">Klicka</a>här för att se en större version av denna siffra. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig2.jpg" /> Figur 2. Termodynamiska parametrar för aktivering av vildtyp och tunnel varianter från enskilda substrat kinetik. (A) Skenbar k cat / K M värden som erhållits från experimentella data och genom att använda ekvationerna 1 och 2 (B) termodynamisk analys med hjälp av övergångsteori och linjär anpassning av de experimentella data till ekvation 3. (C) Termodynamiska parametrar för aktivering beräknade från kurvorna i (B). Den förvikt skvalen substratet visas med bindningar / knäckas så prickade linjer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Figur 3. Termodynamiska parametrar aktivering av vildtyp och tunnel varianter för olika substrat. (A) Relativ k cat / K M värden som erhållits från en pott kinetik med användning av ekvation 4. (B) termodynamiska tomter av kinetiska data vid olika temperaturer med användning av ekvation 5. (C) Absoluta termodynamiska parametrar för aktivering beräknade av ekvation 6 och genom användning av substratet skvalen i fig 2 som referens. Obligationer bildade / trasiga i substraten visas som prickade linjer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes at JoVE.com

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Kanaler för transport av vattenmolekyler i enzymer påverkar aktivt ställe solvatisering och katalys. Häri presenterar vi ett protokoll för konstruktion av dessa ytterligare katalytiska motiv baserade på in silico datormodellering och experiment. Detta kommer att öka vår förståelse av påverkan av lösningsmedel dynamik på enzymkatalys.

Unraveling Entropic Rate Accelerations Inducerad genom lösningsmedels Dynamisk i Membrane Enzymer

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Thermodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

Kylningshastighet Beroende ellipsometri Mätningar som Bestäm Dynamisk av tunna glas- Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiomärkning och kvantifiering av cellulära nivåerna av fosfoinositider från High Performance Liquid Chromatography kopplade Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Upplösning Dynamic Nuclear Polarisering Instrument för Realtids enzymatisk reaktion Rate Mätningar av NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Elektroimpedansspektroskopi som ett verktyg för elektrokemisk hastighet konstant uppskattning

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

Tillverkning av sfäriska och mask-formade Micellar nanokristaller genom att kombinera elektrospray, självmontering och lösningsmedelsbaserade struktur kontroll

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

DNA-magnetiska partikel bindande analys av dynamiska och elektroforetiska ljusspridning

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Visualisera Lignification Dynamics i anläggningar med Klicka på kemi: dubbel märkning är BLISS!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

Fotoelektronen avbildning av anjoner illustrerad av 310 Nm avlossning av F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Niobium Oxide Films Deposited by Reactive Sputtering: Effect of Oxygen Flow Rate

Niobium oxid filmer deponeras genom reaktiv sputtring: effekten av syre flöde

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition ...

Vibrational Spectra of a N719-Chromophore/Titania Interface from Empirical-Potential Molecular-Dynamics Simulation, Solvated by a Room Temperature Ionic Liquid

Vibrational spektra av en N719-Chromophore/Titania Gränssnitt från empirisk-potential molekylär-dynamik simulering, Solvated av en rumstemperatur jonisk vätska