Name: assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation at JoVE.com

The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Alle forsøg er beskrevet i denne protokol i overensstemmelse med NIH retningslinjer i overensstemmelse med de retningslinjer, der er angivet af University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care og brug Udvalg. 1. Neonatal Maternal Separation (NMS) <ol><li> Overvåg gravide moderdyr dagligt for strøelse fødsler. Bemærk: Den dag kuldet er født anses P0. </li><li> På P1, fjerne dæmningen fra hjemmet bur og anbringes i en ren sekundær beholder. </li><li> Gnid en hån...

Denne protokol giver metode til at bruge neonatal stress, i form af NMS, at fremkalde symptomologi tegn på CP / CPP&#39;er i voksne hanmus. Som voksne, de NMS mus viser betydelig perigenital mekanisk allodyni, samt bevis for mastcelledegranulering i prostata væv. Brugen af NMS er en ny tilgang til at udvikle en præklinisk model af CP / CPP ved, at den gentager det tidlige liv stress, der ofte rapporteret af patienter med kroniske bækkensmerter 12-14, samt inkorporering af et ikke-invasiv induktion, som mo...

Kroniske bækkensmerter ikke i sig selv en sygdom, men snarere en sigt er forbundet med den igangværende spontan og / eller fremkaldt smerte oplevet af patienter diagnosticeret med irritabel tarmsyndrom (IBS), interstitiel cystitis / smertefuld blære syndrom (IC / PBS), vulvodynia, eller kronisk prostatitis / kroniske bækkensmerter syndrom (CP / CPP). Disse syndromer er ofte komorbide og deler mange egenskaber i at de ikke har tilknyttet patologi eller identificeret underliggende ætiologi, selv er blevet vist dysfunktion i immunsystemet, centralnervesystemet, og det perifere nervesystem til at bidrage til vedligeholdelse og progression af disse lidelser 1 -3. Patienter med kroniske bækkensmerter er mere tilbøjelige til at præsentere med symptomer på yderligere, ikke-bækken-relaterede funktionelle smertelidelser og affektive lidelser, herunder angst, depression og panikangst 4-6, som er blevet associeret med ændret funktion af hypothalamus- hypofyseadrenal (HPA) aksen 7-10. Udsættelse for tidlige liv stress eller traumer er en væsentlig risikofaktor for udvikling af HPA abnormiteter og tilhørende kroniske smerter syndromer 10,11, og som sådan, rapporterer en betydelig undergruppe af patienter med funktionelle Bækkensmerter lidelser har oplevet negative barndomsoplevelser begivenheder såsom misbrug eller forsømmelse 12-14. Gnaver modeller af neonatal maternal separation (NMS), som indebærer fjernelse af hvalpe fra deres mor for en fastsat periode i løbet af før fravænning periode, er blevet brugt til de sidste to årtier til at studere resultaterne af tidlige liv stress. Generelt har NMS vist sig at øge HPA-akse-aktivering, og resulterende angst-lignende adfærd, ved direkte at påvirke genekspression i hypothalamus, samt forstyrrer nedstrøms regulering fra limbiske strukturer 15-18. Afbrydelse af korrekt HPA akse funktion har vist sig at bidrage til øget kolorektal 19-22 </sup&gt; Og vaginal 16 følsomhed vises af gnaver NMS modeller, men trods omfattende karakterisering af den langsigtede effekt af postnatal blære betændelse 23-25, har effekten af tidlige liv stress stort set gået unstudied i urogenitale organer. Derfor vil følgende undersøgelse beskriver, hvordan du udfører NMS i mus og senere evaluere perigenital mekanisk følsomhed og mast celle infiltration / aktivering i prostata for at validere brugen af ​​mandlige NMS mus som en præklinisk model for CP / CPP&#39;er. Af alle de diagnosticerede kroniske bækkensmerter lidelser, CP / CPP&#39;er er måske den mindst velkendt og karakteriseret syndrom, trods en langtidsprævalens på ca. 14% 26 og årlige patient omkostninger anslås til $ 4400 (det dobbelte af lændesmerter eller rheumatoid arthritis 27). Patienter med CP / CPP rapport smerter i mellemkødet, rektum, prostata, penis, testikler, og / eller maven 28, opleve en hiGher grad af psykologisk stress end kontrolpatienter 29, og almindeligt til stede med symptomer på eller er diagnosticeret med komorbide kroniske bækkensmerter eller humørsvingninger 5,29-31. Tilbagevendende infektion, utætte epitel, neurogen inflammation, og autoimmunitet er alle blevet formodet som potentielle underliggende årsager til CP / CPP 2,32,33 samt mastcelleaktivering og degranulering 34. Udtrykte prostatasecerneringer fra mænd med CP / CPP var steget mastcelletryptase og nervevækstfaktor (NGF) niveauer 34, og en senere undersøgelse bekræftede, at tryptase og carboxypeptidase A (CPA3), en markør for mastcelleaktivering, blev også forøget i urin fra CP / CPP patienter 35. Den potentielle rolle for mastceller i indtræden og opretholdelse af CP / CPP har været et stort fokus for animalsk forskning på dette syndrom hidtil. Den mest almindeligt anvendte gnaver-model anvendes til at undersøge CP / CPP er en eksperimentel autoimmun prostatitis (EAP) model genbejdede ved subkutan injektion af prostata antigen i Freunds komplette adjuvans, hvilket resulterer i forskellige grader af prostata inflammation afhængig af art og stamme anvendes 34,36-39. Mast celle infiltration og aktivering / degranulation har vist sig at stige efter induktion af EAP 34,35,40. Transgene mus mangler enten mastceller 34 eller tryptase receptor PAR2 35 ikke udvikler prostata taktik følsomhed efter EAP modsætning vildtype EAP mus. Mens dette prækliniske model replikerer mange af de særlige kendetegn ved den menneskelige CP / CPP&#39;er, induktion protokollen er ikke udtryk for den menneskelige tilstand, som har en varieret ætiologi og ofte involverer ikke direkte inflammation, infektion eller skade af prostata. Indflydelsen af ​​tidlige liv stress på udvikling af CP / CPP hos mennesker er stort set gået ikke undersøgt; Men en undersøgelse fra Hu, et al. 41, viste, at mign som rapporterede en historie af barndommen fysiske, følelsesmæssige og / eller seksuelle overgreb var signifikant mere tilbøjelige til at opleve symptomer på CP / CPP&#39;er. De viste desuden, at både smerte og urinveje scoringer blev øget hos patienter med en historie af fysisk og følelsesmæssig misbrug. Vi har tidligere vist, at den samme NMS paradigme i kvindelig C57BL / 6 mus producerer vaginal overfølsomhed og unormal genekspression i både vagina og blære antyder dysfunktionel HPA-akse-udgang 16. Dette beviser kombineret med den høje forekomst af CP / CPP&#39;er patienter med andre co-morbiditet 42, herunder IC / PBS og humørsvingninger, der er mere tydeligt vist sig at være forbundet med tidlige liv stress eksponering 12-14, giver rationalet for at bruge en NMS model til at undersøge CP / CPP i mus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

Kronisk prostatitis / kronisk bækkensmerter syndrom (CP / CPP&#39;er) har en levetid prævalens på 14% og er den mest almindelige urologisk diagnose for mænd under 50 år, men det er det mindste forstået og studerede kroniske bækkensmerter lidelse. En væsentlig undergruppe af patienter med kroniske bækkensmerter rapport have oplevet tidligt i livet stress eller misbrug, som kan påvirke markant funktion og regulering af hypothalamus-hypofyse-binyre (HPA) aksen. Mastcelleaktivering, hvilket har vist sig at blive forøget i både urin og udtrykt prostatasecerneringer af CP / CPP patienter, er delvist reguleret af nedstrøms aktivering af HPA-aksen. Neonatal maternal separation (NMS) er blevet anvendt i mere end to årtier at studere resultaterne af tidlige liv stress i gnavermodeller, herunder ændringer i HPA-aksen og visceral følsomhed. Her giver vi en detaljeret protokol for brug af NMS som en præklinisk model af CP / CPP&#39;er hos mandlige C57BL / 6 mus. Vi beskriver metodentil udførelse af NMS, vurderer perigenital mekanisk allodyni og histologiske tegn på mastcelleaktivering. Vi tilbyder også dokumentation for, at tidlig psykologisk stress kan have langvarige effekter på den mandlige urogenitale system hos mus.

Mus, der har undergået NMS viste adfærdsmæssige beviser indikerer CP / CPP. Når det testes med en gradueret serie af von Frey-monofilamenter, 8 uger gamle NMS mus (n = 4) vises perigenital mekanisk allodyni sammenlignet med naive modstykker (n = 5, figur 2). Dette fremgår som en signifikant reduktion (p &lt;0,01; t-test) i den mekaniske tilbagetrækningstærskel der fremkaldte en positiv adfærdsmæssig reaktion, registreres som en rask ryk eller hoppe som reaktion på monofilament ansøgn...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation at JoVE.com

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Vi måler perigenital mekanisk følsomhed og mastcelleaktivering i prostata af C57BL / 6 mus, der undergik en tidlig liv stress paradigme - neonatal maternal separation, for at inducere en præklinisk model af kronisk prostatitis / kronisk bækkensmerter syndrom.

Vurdering af Perigenital Følsomhed og prostata mastcelleaktivering i en musemodel for Neonatal Maternal Separation

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

A Swine Model of Neonatal Asphyxia

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

En Grisling Model for Neonatal Hypoksisk-iskæmisk encephalopati

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

Motor and Hippocampal Dependent Spatial Learning and Reference Memory Assessment in a Transgenic Rat Model of Alzheimer's Disease with Stroke

Motor og Hippocampal Afhængige Spatial læring og reference Memory Vurdering i en Transgene Rat Model af Alzheimers sygdom med Stroke

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease that results in neurodegeneration and memory loss. While age is a major risk ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En Neonatal Mouse rygmarvskompression Skade Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

Et batteri af Motor Tests i en Neonatal Mouse Model of cerebral parese

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myokardieinfarkt i neonatale mus, en model af Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet måling af musen mesenterica arterie ved hjælp af Wire blodkar

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

En Kryoskade model til undersøgelse af myokardieinfarkt i mus

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...