Name: assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation at JoVE.com

The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Toutes les expériences décrites dans ce protocole sont conformes aux directives du NIH en conformité avec les orientations définies par l&#39;Université du Kansas Medical Center Institutional Animal Care et l&#39;utilisation Comité. 1. Séparation néonatale maternelle (NMS) <ol><li> Surveiller barrages enceintes quotidienne pour les naissances de litière. Remarque: Le jour de la litière est né est considéré P0. </li><li> Sur P1, enlever le barrage de la cage de la maison...

Ce protocole fournit une méthodologie pour utiliser le stress néonatal, sous la forme de NMS, pour induire une symptomatologie indicatif de CP / CPPS chez les souris mâles adultes. Comme les adultes, les souris NEM affichent allodynie mécanique périgénitale importante, ainsi que la preuve de la dégranulation des mastocytes dans le tissu de la prostate. L&#39;utilisation de NMS est une nouvelle approche pour développer un modèle préclinique de CP / CPPS en ce qu&#39;elle reproduit le stress de la vie au début ...

La douleur pelvienne chronique est pas en soi une maladie, mais plutôt un terme associé à la douleur continue spontanée et / ou évoquée vécue par les patients diagnostiqués avec le syndrome du côlon irritable (IBS), la cystite interstitielle / syndrome de la vessie douloureuse (IC / PBS), vulvodynie, ou le syndrome de douleur pelvienne prostatite chronique / chronique (CP / CPPS). Ces syndromes sont souvent des comorbidités et partagent beaucoup de caractéristiques en ce qu&#39;ils présentent aucune pathologie associée ou étiologie identifiée, bien que a été montré un dysfonctionnement dans le système immunitaire, le système nerveux central et le système nerveux périphérique de contribuer à l&#39;entretien et à la progression de ces troubles 1 -3. Les patients souffrant de douleurs pelviennes chroniques sont plus susceptibles de présenter des symptômes de plus, non-pelvienne liée à des troubles fonctionnels de la douleur et des troubles de l&#39;humeur, y compris l&#39;anxiété, la dépression et le trouble panique 4-6, qui a été associée avec le fonctionnement altéré de la hypothalamo hypophysosurrénalien (HHS) 7-10. L&#39;exposition au stress de la vie au début ou à un traumatisme est un facteur de risque important pour le développement des anomalies HPA et les syndromes de douleur chronique associée 10,11 et, comme tel, un sous-ensemble significatif de patients atteints de troubles de douleur pelvienne fonctionnels ont indiqué avoir vécu les événements de l&#39;enfance indésirables tels que l&#39;abus ou la négligence 12-14. des modèles de rongeurs de la séparation maternelle néonatale (SMN), qui consiste à enlever les chiots de leur mère pour une période de temps au cours de la période d&#39;avant le sevrage, ont été utilisées pour les deux dernières décennies pour étudier les résultats de début de stress de la vie. En général, NMS a été montré pour augmenter l&#39;activation de l&#39;axe HPA, et les comportements de type anxieux qui en résultent, en affectant directement l&#39;expression des gènes dans l&#39;hypothalamus, ainsi que de perturber la régulation en aval de structures limbiques 15-18. Perturbation du bon fonctionnement de l&#39;axe HHS a été montré pour contribuer à l&#39;augmentation colorectal 19-22 </sup&gt; Vaginale et 16 sensibilité affichée par les modèles de NMS de rongeurs, mais malgré une caractérisation de l&#39;effet à long terme de 23-25 ​​postnatale inflammation de la vessie, de l&#39;impact de début stress de la vie a largement pas été étudié dans les organes génito-urinaires. Par conséquent, l&#39;étude suivante décrira comment effectuer NMS chez les souris et plus tard d&#39;évaluer la sensibilité mécanique périgénitale et l&#39;infiltration des mastocytes / activation dans la prostate pour valider l&#39;utilisation de souris mâles NMS comme un modèle préclinique pour CP / CPPS. De tous les troubles diagnostiqués de douleurs pelviennes chroniques, CP / CPPS est peut-être le syndrome de moins bien reconnu et caractérisé, en dépit d&#39;une prévalence à vie d&#39;environ 14% 26 et les coûts annuels de patients estimés à $ 4400 (deux fois celle de la lombalgie ou la polyarthrite retour l&#39;arthrite 27). Les patients atteints de CP / CPPS rapport douleurs au niveau du périnée, du rectum, de la prostate, pénis, testicules, et / ou à l&#39;abdomen 28, l&#39;expérience d&#39;un salutgher degré de stress psychologique que les patients témoins 29, et couramment présente avec des symptômes de ou sont diagnostiqués avec la douleur ou les troubles de l&#39;humeur pelviennes chroniques concomitantes 5,29-31. Infection récurrente, l&#39;épithélium qui fuit, une inflammation neurogène, et l&#39;auto-immunité ont tous été supposé que les causes sous-jacentes potentielles de CP / CPPS 2,32,33, ainsi que l&#39;activation des mastocytes et la dégranulation 34. Sécrétions prostatiques exprimé à partir d&#39;hommes atteints de CP / CPPS avaient augmenté tryptase des mastocytes et le facteur de croissance des nerfs (NGF) niveaux 34, et une étude plus récente confirme que la tryptase et la carboxypeptidase A (CPA3), un marqueur de l&#39;activation des mastocytes, ont également été augmenté dans le urine de patients CP / CPPS 35. Le rôle potentiel des mastocytes dans l&#39;apparition et le maintien de CP / CPPS a été une préoccupation majeure de la recherche animale sur ce syndrome jusqu&#39;ici. Le modèle de rongeur le plus couramment employé utilisé pour étudier CP / CPPS est une prostatite auto-immune expérimentale (PAE) modèle gensurvoltage par injection sous-cutanée de l&#39;antigène de la prostate dans de l&#39;adjuvant complet de Freund, qui se traduit par des degrés variés de l&#39;inflammation de la prostate selon l&#39;espèce et la souche utilisée 34,36-39. Il a été démontré infiltration de cellules de mât et l&#39;activation / dégranulation à augmenter après l&#39;induction de l&#39;EAP 34,35,40. Les souris transgéniques déficientes en soit mastocytes 34 ou le récepteur PAR2 tryptase 35 ne développent pas la sensibilité de la prostate tactique suivante EAP, contrairement aux souris de type sauvage du PAE. Bien que ce modèle préclinique reproduit bon nombre des caractéristiques de CP humaine / CPPS, le protocole d&#39;induction ne sont pas indicatifs de la condition humaine, qui a une étiologie diverse et souvent ne comporte pas l&#39;inflammation directe, une infection ou une blessure de la prostate. L&#39;influence de début stress de la vie sur le développement de CP / CPPS chez les humains est largement passée objet d&#39;aucune enquête; Toutefois, une étude menée par Hu et al. 41, a démontré que moin qui ont rapporté une histoire de physique de l&#39;enfance, émotionnel, et / ou d&#39;abus sexuels étaient beaucoup plus susceptibles d&#39;éprouver des symptômes évocateurs d&#39;CP / CPPS. En outre, ils ont montré que la douleur et les scores urinaires ont été augmentées chez les patients ayant des antécédents de violence physique et psychologique. Nous avons précédemment démontré que le même paradigme dans NMS femelle C57BL / 6 souris produit une hypersensibilité vaginal et l&#39;expression du gène anormal à la fois dans le vagin et la vessie suggestif de sortie de l&#39;axe HPA 16 dysfonctionnelle. Cette preuve combiné avec la forte prévalence de CP / CPPS patients présentant des comorbidités 42 autres, y compris les IC / PBS et troubles de l&#39;humeur, qui ont été présentées plus clairement être lié à la vie tôt le stress exposition 12-14, fournit la justification de l&#39;utilisation d&#39;un NMS modèle d&#39;enquêter CP / CPPS chez la souris.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

La prostatite chronique / syndrome de la douleur pelvienne chronique (CP / CPPS) a une prévalence à vie de 14% et est le diagnostic urologique la plus courante pour les hommes de moins de 50 ans, mais il est le trouble le moins bien compris et a étudié la douleur pelvienne chronique. Un sous-ensemble significatif de patients avec le rapport de la douleur pelvienne chronique ayant connu le stress de début de la vie ou d&#39;abus, ce qui peut sensiblement affecter le fonctionnement et la régulation du (HPA) axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien. L&#39;activation des mastocytes, qui a été montré à être augmentée dans l&#39;urine et exprimé sécrétions prostatiques de patients CP / CPPS, est partiellement régulée par activation en aval de l&#39;axe HPA. La séparation maternelle néonatale (NMS) a été utilisé pendant plus de deux décennies à étudier les résultats de début de stress de la vie dans les modèles de rongeurs, y compris les changements dans l&#39;axe HPA et la sensibilité viscérale. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l&#39;utilisation de NMS comme un modèle préclinique de CP / CPPS dans C57BL / 6 souris mâles. Nous décrivons la méthodologiepour effectuer NMS, évaluer allodynie mécanique périgénitale, et la preuve histologique de l&#39;activation des mastocytes. Nous fournissons également des preuves que le stress psychologique précoce peut avoir des effets à long terme sur le système génito-urinaire masculin chez la souris.

Les souris qui ont subi NMS a montré des preuves de comportement indicatif de CP / CPPS. Lors d&#39;un essai avec une série graduée de monofilaments von Frey, souris NMS 8 semaines-vieux (n = 4) affiché allodynie mécanique périgénitale par rapport à leurs homologues naïfs (n = 5, figure 2). Ceci est démontré qu&#39;une réduction significative (p &lt;0,01; test t de Student) dans le seuil de retrait mécanique qui a suscité une réaction positive des comportements, enregistrée comm...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Nous mesurons activation périgénitale mécanique de la sensibilité et des mastocytes dans la prostate des hommes C57BL / 6 qui a subi un début de paradigme du stress de la vie - la séparation maternelle néonatale, afin d&#39;induire un modèle préclinique de syndrome chronique de la prostatite chronique / de douleurs pelviennes.

Évaluation de la sensibilité et de la prostate péri-Mast Cell Activation dans un modèle murin de la séparation maternelle néonatale

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