Name: assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation at JoVE.com

The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente entsprechen den NIH-Richtlinien im Einklang mit den von der University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee festgelegten Richtlinien. 1. Neugeborene von Müttern Separation (NMS) <ol><li> Überwachen Sie schwanger Dämme täglich Wurf Geburten. Hinweis: Der Tag der Wurf ist geboren wird als P0. </li><li> Auf P1, entfernen Sie die Staumauer aus dem Käfig und in einen sauberen Sekundärbehälter....

Dieses Protokoll sieht Vorgehen beim Einsatz von Stress beim Neugeborenen ist, in Form von NMS, um Symptomatik bezeichnend für CP / CPPS in erwachsenen männlichen Mäusen zu induzieren. Als Erwachsene, zeigen die NMS-Mäusen signifikant perigenital mechanischer Allodynie, sowie Hinweise auf Mastzelldegranulation in Prostatagewebe. Die Verwendung von NMS ist ein neuer Ansatz zur Entwicklung eines präklinischen Modell der CP / CPPS, dass sie repliziert die frühen Leben Stress, die häufig von Patienten mit chronischen...

Chronische Schmerzen im Beckenbereich ist an sich nicht eine Krankheit, sondern ein Begriff, mit dem anhaltenden spontanen und / oder evozierte Schmerzen von Patienten mit Reizdarmsyndrom (IBS) diagnostiziert erlebt, interstitielle Zystitis / schmerzhafte Blasen-Syndrom (IC / PBS), vulvodynia verbunden sind, oder chronische Prostatitis / chronischem Schmerzsyndrom des Beckens (CP / CPPS). Diese Syndrome werden oft komorbid und teilen viele Eigenschaften, daß sie keine assoziierten Pathologie oder identifiziert zugrunde liegende Ätiologie, obwohl Dysfunktion im Immunsystem, das zentrale Nervensystem und peripheren Nervensystem wurde gezeigt, dass für den Unterhalt und das Fortschreiten dieser Erkrankungen beitragen 1 -3. Patienten mit chronischen Unterbauchschmerzen sind eher mit Symptomen präsentieren zusätzliche, nicht-Beckenbezogene Funktionsschmerzstörungen und affektiven Störungen, einschließlich Angstzustände, Depressionen, Panikattacken 4-6, die mit einer veränderten Funktion des Hypothalamus in Verbindung gebracht wurde Hypophyseadrenalen (HPA) Achse 7-10. Die Exposition gegenüber den ersten Lebens Stress oder Trauma ist ein signifikanter Risikofaktor für die Entwicklung von HPA Anomalien und die damit verbundenen chronischen Schmerzsyndromen 10,11 und als solche, berichten über einen erheblichen Teil der Patienten mit funktionellen Beckenschmerzerkrankungen mit erfahrenen negativen Kindheitsereignisse wie Missbrauch oder Vernachlässigung 12-14. Nagetiermodellen der Neugeborenen von Müttern Trennung (NMS), die das Entfernen der Jungtiere von ihren Damm für einen bestimmten Zeitraum während der Entwöhnung Zeitraum beinhaltet, haben in den vergangenen zwei Jahrzehnten eingesetzt, um die Ergebnisse der frühen Leben Stress zu studieren. Im Allgemeinen NMS wurde gezeigt, dass HPA-Achse Aktivierung und die daraus resultierende Angst-ähnliche Verhaltensweisen zu erhöhen, indem die Genexpression direkt betreffen im Hypothalamus sowie stören nachgeschaltete Regelung von limbischen Strukturen 15-18. Störung der ordnungsgemäßen Funktionsweise HPA-Achse hat sich gezeigt, zu mehr kolorektalen 19-22 beitragen </sup&gt; Und vaginale 16 Empfindlichkeit von Nagetier NMS Modelle angezeigt, aber trotz intensiver Charakterisierung der Langzeitwirkung der postnatalen Blasenentzündung 23-25, die Auswirkungen der frühen Leben Stress weitgehend unerforscht in der urogenitalen Organe weg. Daher wird die folgende Studie beschreiben die NMS bei Mäusen durchgeführt und später auszuwerten perigenital mechanische Empfindlichkeit und Mastzellinfiltrate / Aktivierung in der Prostata, um die Verwendung von männlichen Mäusen NMS als präklinischen Modell CP / CPPS- validieren. Aller diagnostizierten chronischen Unterbauchschmerzen Erkrankungen ist CP / CPPS vielleicht die am wenigsten gut erkannt und gekennzeichnet Syndrom, trotz einer Lebenszeitprävalenz von etwa 14% 26 und $ 4400 (geschätzte jährliche Patientenkosten doppelt so hoch wie Rückenschmerzen oder rheumatoider Arthritis 27). Patienten mit CP / CPPS Bericht Schmerzen in den Damm, des Mastdarms, der Prostata, Penis, Hoden, und / oder Bauch 28, erleben Sie eine hallogher Maß an psychischer Stress als Kontrollpatienten 29, und üblicherweise mit Symptomen oder Gegenwart mit komorbiden chronischen Unterbauchschmerzen oder affektiven Störungen 5,29-31 diagnostiziert. Wiederkehrende Infektion, undichte Epithel, neurogene Entzündung und Autoimmunität alle als potentielle Ursachen der CP / CPPS- 2,32,33 sowie Aktivierung von Mastzellen-Degranulation und 34 wurde vermutet. Ausgedrückt Prostatasekret von Männern mit CP / CPPS hatte 34 Mastzelltryptase und Nervenwachstumsfaktor (NGF) Ebenen erhöht und eine spätere Studie bestätigt, dass Tryptase und Carboxypeptidase A (CPA3), einem Marker der Mastzellaktivierung, wurden auch in der erhöhten Urin von CP / CPPS Patienten 35. Die mögliche Rolle für die Mastzellen bei der Entstehung und Aufrechterhaltung des CP / CPPS ist ein wichtiger Schwerpunkt der Tierforschung auf diesem Syndrom bisher. Die am häufigsten verwendeten Tiermodell verwendet werden, um zu studieren CP / CPPS ist eine experimentelle autoimmune Prostatitis (EAP) Modell gendurch subkutane Injektion von Prostata-Antigen in komplettem Freundschen Adjuvans, das auf verschiedene Grade von Prostataentzündung je nach Tierart und Stamm 34,36-39 ergibt erated. Mastzellinfiltration und Aktivierung / Degranulation wurde gezeigt, dass nach der Induktion von EAP 34,35,40 erhöhen. Transgene Mäuse mangelhaft in Mastzellen entweder 34 oder Tryptase Rezeptor PAR2 35 nicht entwickeln Prostata Taktik Empfindlichkeit folgenden EAP, im Gegensatz zu Wildtyp-Mäusen EAP. Während dieser präklinischen Modell gibt viele der Eigenschaften des menschlichen CP / CPPS, ist die Induktion Protokoll nicht indikativ für den menschlichen Zustand, die eine vielfältige Ätiologie hat und oft keinen direkten Entzündungen, Infektionen oder Verletzungen der Prostata nicht einzubeziehen. Der Einfluss der frühen Leben Stress auf die Entwicklung von CP / CPPS bei den Menschen wurde nicht untersucht weitgehend gegangen; aber eine Studie von Hu et al. 41, gezeigt, dass michn, die eine Geschichte der Kindheit körperliche, emotionale gemeldet, und / oder sexuellem Missbrauch wurden wesentlich häufiger zu Symptomen, die CP / CPPS erleben. Darüber hinaus zeigten sie, dass sowohl Schmerzen und Harnwege Werte wurden bei Patienten mit einer Vorgeschichte von physischen und emotionalen Missbrauch erhöht. Wir haben zuvor gezeigt, dass die gleichen NMS Paradigma bei weiblichen C57BL / 6-Mäusen produziert vaginalen Überempfindlichkeit und abnormale Genexpression sowohl in die Vagina und Blase andeutend dysfunktionalen HPA-Achse Ausgang 16. Dieser Nachweis kombiniert mit der hohen Prävalenz von CP / CPPS Patienten mit anderen Begleiterkrankungen 42, einschließlich IC / PBS und affektive Störungen, die mehr klar gezeigt worden, um mit den ersten Lebensstressexposition 12-14 verbunden werden können, liefert die Begründung für die Verwendung einer NMS Modell CP / CPPS bei Mäusen zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

Chronische Prostatitis / chronischem Schmerzsyndrom des Beckens (CP / CPPS) hat eine Lebenszeitprävalenz von 14% und ist die häufigste urologische Diagnose bei Männern im Alter von 50, aber es ist die am wenigsten verstanden und untersucht chronischen Unterbauchschmerzen Störung. Ein wesentlicher Teil der Patienten mit chronischen Unterbauchschmerzen Bericht mit frühen Leben Stress oder Missbrauch, die deutlich die Funktion und Regulation der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (HPA) Achse beeinflussen können erlebt. Mastzellaktivierung, die gezeigt wurde, dass in Urin erhöht und exprimiert Prostatasekreten von CP / CPPS- Patienten wird teilweise durch nachgeschaltete Aktivierung der HPA-Achse reguliert wird. Neugeborene von Müttern Trennung (NMS) ist seit mehr als zwei Jahrzehnten eingesetzt, um die Ergebnisse der frühen Leben Stress in Nagetiermodellen zu studieren, einschließlich Änderungen der HPA-Achse und viszeralen Empfindlichkeit. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von NMS als präklinischen Modell der CP / CPPS in männlichen C57BL / 6 Mäusen. Wir beschreiben die Methodikzur Durchführung von NMS, die Beurteilung perigenital mechanischer Allodynie und histologischem Nachweis einer Mastzellaktivierung. Wir bieten auch Hinweise darauf, dass Anfang psychischer Stress kann langfristige Auswirkungen auf die männlichen Urogenitalsystems bei Mäusen haben.

Mäuse, die NMS unterzogen wurden, zeigten Verhaltenshinweise anzeigt CP / CPPS. Wenn es mit einer abgestuften Reihe von Frey-Monofilamenten, 8 Wochen alten NMS Mäusen getestet (n = 4) dargestellt perigenital mechanischer Allodynie im Vergleich zu naiven Pendants (n = 5, 2). Dies wird als eine signifikante Reduktion (p &lt;0,01; Student-t-Test) belegt in der mechanischen Rücknahmeschwelle, die eine positive Verhaltensreaktion ausgelöst, als rege Ruck oder Sprung in Reaktion auf Monofil Anwen...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Wir messen perigenital mechanische Empfindlichkeit und Mastzellaktivierung in der Prostata von männlichen C57BL / 6-Mäuse, die eine frühe Leben Stress Paradigma erfuhr - Neugeborenen von Müttern Trennung, um einen präklinischen Modell der chronischen Prostatitis / chronischem Schmerzsyndrom des Beckens zu induzieren.

Bewertung der perigenital Sensitivität und Prostatic Mastzellaktivierung in einem Mausmodell der Neonatal Maternal Separation

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

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