Name: assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation at JoVE.com

The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

このプロトコルで説明されているすべての実験は、カンザスメディカルセンター制度動物実験委員会の大学で指定されたガイドラインに従ってNIHガイドラインに準拠しています。 1.新生児母子分離（NMS） <ol><li>ごみの出生のために毎日妊娠ダムを監視します。 注：ゴミが生まれた日はP0と考えられています。 </li><li> P1には、ホームケージからダムを削除し、クリ?...

このプロトコルは、成体雄マウスにCP / CPPSを示す症状を誘導するために、NMSの形で、新生児のストレスを使用するための方法を提供します。大人として、NMSマウスはかなりのperigenital機械的異痛、ならびに前立腺組織における肥満細胞の脱顆粒の証拠が表示されます。 NMSを使用すると、として、それは多くの場合、慢性骨盤痛12-14の患者によって報告された初期の生活上のストレスを...

慢性骨盤痛自体は病気ではなく、過敏性腸症候群（IBS）と診断された患者が経験した継続的な自発的および/または誘発痛、間​​質性膀胱炎/膀胱痛症候群（IC / PBS）、外陰部痛に関連した用語、または慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群（CP / CPPS）。これらの症候群は、機能不全が、免疫系、中枢神経系および末梢神経内のシステムは、これらの疾患1の維持および進行に寄与することが示されているが、彼 ​​らは、いかなる関連する病状または同定根底にある病因を持っていない多くの場合、合併され、その中に多くの特徴を共有します-3。慢性骨盤痛を有する患者は、視床の変更された機能に関連付けられている不安、うつ病、パニック障害4-6を含む追加の非骨盤に関連する機能性疼痛障害および気分障害の症状で存在する可能性が高いです下垂体副腎（HPA）軸7-10。初期生活ストレスやトラウマへの暴露がHPAの異常と関連する慢性疼痛症候群10,11と、などを開発するための重要な危険因子であり、機能性骨盤痛障害を有する患者のかなりの部分集合は、虐待やネグレクトなどの有害幼年期の事象を経験したと報告します12-14。 離乳前の期間に設定された時間のために彼らのダムから子犬を除去することを含む、新生児母体の分離（NMS）のげっ歯類モデルは、初期の生活上のストレスの成果を研究するために過去20年間のために使用されています。一般に、NMSは、直接視床下部内での遺伝子発現に影響を与えるだけでなく、辺縁構造15-18から下流調節を破壊することによって、HPA軸の活性化、及び得られた不安様行動を増加させることが示されています。適切なHPA軸機能の破壊が増加大腸19-22に寄与することが示されています</sup&gt;と膣16の感度は、げっ歯類NMSモデルによって表示されますが、出生後の膀胱炎23-25 ​​の長期的な効果の大規模な特性評価にもかかわらず、早期の生活上のストレスの影響は、主に尿生殖器官で自然と口から出た行ってきました。そのため、以下の研究は、マウスにおけるNMSを実行し、それ以降のCP / CPPSのための前臨床モデルとしての雄NMSマウスの使用を検証するために、前立腺にperigenital機械的感度および肥満細胞の浸潤/活性化を評価する方法について説明します。 診断慢性骨盤疼痛性障害のすべての、CP / CPPSは、おそらく最もよく認識し、シンドロームを特徴とする、約14〜26％の生涯有病率を有し、4400ドルで推定年間患者のコストにもかかわらず、（その倍腰痛やリウマチの関節炎27）。 CP / CPPS報告会陰部の痛み、直腸、前立腺、陰茎、睾丸、および/ ​​または腹部28の患者は、ハイテクを体験しますgher対照患者よりも心理的ストレス度29、およびまたは症状と共通して存在が併存する慢性骨盤痛や気分障害5,29-31と診断されています。再発感染、漏れやすい上皮、神経性炎症、および自己免疫は、すべての潜在的な基礎となるCP / CPPS 2,32,33の原因だけでなく、肥満細胞の活性化および脱顆粒34として推測されてきました。 CP / CPPS有する男性から発現前立腺分泌物は、マスト細胞トリプターゼおよび神経成長因子（NGF）のレベル34が増加した、後の研究では（CPA3）のトリプターゼおよびカルボキシペプチダーゼことが確認され、マスト細胞活性化のマーカーもで増加しましたCP / CPPS患者35の尿。 CP / CPPSの発症と維持に肥満細胞の潜在的な役割は、これまでにこの症候群の動物研究の主要な焦点となっています。 CP / CPPSを研究するために使用される最も一般的に用いられる齧歯類モデルは、実験的自己免疫性前立腺炎（EAP）モデルGENです34,36-39使用される種および株に依存前立腺の炎症の多様度になり、完全フロイントアジュバント、前立腺抗原の皮下注射によってerated。マスト細胞の浸潤および活性化/脱顆粒は、EAP 34,35,40の次の誘導を増加させることが示されています。マスト細胞34またはトリプターゼ受容体PAR2 35のいずれかを欠損したトランスジェニックマウスは、野生型EAPマウスとは異なり、EAP次の前立腺戦術感度を開発することはありません。この前臨床モデルがヒトのCP / CPPSの特徴の多くを複製しながら、誘導プロトコールは、多様な病因を持っており、多くの場合、直接炎症、感染、または前立腺の傷害を伴わない人間の状態、を示すものではありません。 ヒトでのCP / CPPSの開発に初期の生活上のストレスの影響は、主に未調査行ってきました。しかし、胡ら 41による研究では、私のことを実証しましたN人は、物理的、感情的、および/または性的虐待の子供時代の歴史は、CP / CPPSを示唆する症状を経験する可能性が有意に高かったと報告しました。さらに、彼らは痛みや尿のスコアの両方が物理的および精神的虐待の既往歴のある患者において増加していることが示されました。我々は以前の雌C57BL / 6マウスは、膣および機能不全HPA軸出力16の両方を示唆する膀胱内、膣過敏症および異常な遺伝子発現を生成するのと同じNMSパラダイムことを実証しました。より明確に初期生活ストレス暴露12-14と関連していることが示されているIC / PBSおよび気分障害を含む他の併存疾患42、と提示CP / CPPS患者の有病率が高いと組み合わせてこの証拠は、使用するための理論的根拠を提供しますNMSモデルは、マウスにおけるCP / CPPSを調査します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群（CP / CPPS）14％の生涯有病率を持っており、50歳未満の男性のための最も一般的な泌尿器科診断である、まだそれは少なくとも、慢性骨盤痛障害を理解し、研究しています。著しく視床下部 - 下垂体 - 副腎（HPA）軸の機能および調節に影響を与える可能性が初期生活ストレスや虐待を経験した慢性骨盤痛の報告、患者のかなりの部分集合。両方の尿中で増加することが示されており、CP / CPPS患者の前立腺分泌物を発現しているマスト細胞の活性化は、部分的にHPA軸の下流の活性化によって調節されます。新生児母性分離（NMS）は、HPA軸と内臓感度の変更を含む、齧歯類モデルで初期生活ストレスの成果を研究するために20年以上前から使用されてきました。ここでは、雄のC57BL / 6マウスにおいて、CP / CPPSの前臨床モデルとしてNMSを使用するための詳細なプロトコルを提供します。我々は、方法論を記述しますNMSを行うため、perigenital機械的異痛症、及び肥満細胞の活性化の組織学的証拠を評価します。また、初期の心理的ストレスがマウスにおいて男性の泌尿生殖器系の長期的な効果を持つことができるという証拠を提供します。

NMSを受けたマウスは、CP / CPPSを示す行動の証拠を示しました。フォン·フレイモノフィラメント、8週齢のマウスNMS一連の段階的に試験した場合（N = 4）ナイーブ対応物と比較した場合、perigenital機械的異痛を表示（N = 5、 図2）。モノフィラメントに向けモノフィラメントアプリケーションまたは舐めるまたはかむ行動に応じて、活発なジャークまたはジャンプとして記録、正の?...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群の前臨床モデルを誘導するために、新生児の母体の分離 - 私たちは、初期生活ストレスパラダイムを受けた雄のC57BL / 6マウスの前立腺におけるperigenital機械的感度および肥満細胞の活性化を測定しています。

新生児母子分離のマウスモデルにおけるPerigenital感度と前立腺肥満細胞の活性化の評価

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