Name: assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation at JoVE.com

The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Alle forsøkene beskrevet i denne protokollen i samsvar med NIH retningslinjer i samsvar med de retningslinjer som er angitt av University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care og bruk komité. 1. Neonatal Maternal Separasjon (NMS) <ol><li> Overvåke gravide demninger daglig for søppel fødsler. Merk: Dagen kullet er født anses P0. </li><li> På P1, fjerne demningen fra hjemmet buret og plasser i en ren sekundær container. </li><li> Gni en håndfull av sengetøy mell...

Denne protokollen gir metodikk for bruk av neonatal stress, i form av NMS, å indusere symptomologi indikasjon på CP / CPP hos voksne mannlige mus. Som voksne, NMS mus viser signifikant perigenital mekanisk allodyni, samt bevis for degranulering av mastceller i prostatavev. Bruken av NMS er en ny tilnærming til utvikling av en preklinisk modell av CP / CPP ved at det replikerer tidlig i livet stress som blir ofte rapportert av pasienter med kronisk underlivssmerter 12-14, i tillegg til at den inneholder en ...

Kroniske bekkensmerter er ikke i seg selv en sykdom, men snarere et begrep knyttet til den pågående spontan og / eller fremkalt smerte oppleves av pasienter med diagnosen irritabel tarm syndrom (IBS), interstitiell cystitt / smertefull blære (IC / PBS), vulvodynia, eller kronisk prostatitt / kronisk bekkensmertesyndrom (CP / CPP). Disse syndromene er ofte comorbid og deler mange egenskaper ved at de har ingen assosiert patologi eller identifisert underliggende etiologi, men dysfunksjon i immunsystemet, sentralnervesystemet og det perifere nervesystemet har vist seg å bidra til å opprettholde og progresjon av disse lidelsene 1 -3. Pasienter med kronisk bekkensmerte er mer sannsynlig å presentere med symptomer på flere, ikke-bekken relaterte funksjonelle smerteforstyrrelser og humørforstyrrelser, inkludert angst, depresjon, panikklidelse og 4-6, som er blitt assosiert med endret funksjon av hypothalamic- hypofysebinyre (HPA) aksen 7-10. Eksponering for tidlig liv stress eller traumer er en betydelig risikofaktor for å utvikle HPA misdannelser og tilhørende kroniske smertesyndromer 10,11, og som sådan, rapporterer en betydelig undergruppe av pasienter med funksjonelle bekkensmerter lidelser etter å ha opplevd uønskede barndommen hendelser som overgrep eller omsorgssvikt 12-14. Gnager modeller av neonatal mors separasjon (NMS), som innebærer å fjerne valpene fra sin dam for en viss periode av tid i løpet av preweaning perioden, har vært brukt i de siste to tiårene for å studere resultatene av tidlig liv stress. Generelt har NMS vist å øke HPA akse-aktivering, og resulterende angstlignende oppførsel, ved direkte påvirker genekspresjon i hypothalamus, samt forstyrre nedstrøms regulering fra limbiske strukturer 15-18. Forstyrrelse av riktig HPA-akse funksjon har vist seg å bidra til øket tykk- 19-22 </sup&gt; Og vaginal 16 sensitivitet vises av gnager NMS-modeller, men til tross for omfattende karakterisering av den langsiktige effekten av postnatal blærebetennelse 23-25, har virkningen av tidlig liv stress i stor grad gått unstudied i urogenitale organer. Derfor vil følgende studie beskriver hvordan du utfører NMS i mus og senere evaluere perigenital mekanisk følsomhet og mastcelleinfiltrasjon / aktivering i prostata å validere bruk av mannlige NMS mus som en preklinisk modell for CP / CPP. Av alle de diagnostiserte kroniske bekkensmerter lidelser, er CP / CPP kanskje den minst godt anerkjent og preget syndrom, til tross for at en livstidsprevalens på rundt 14% 26 og årlige pasientkostnader anslått til $ 4400 (det dobbelte av ryggsmerter eller revmatoid arthritis 27). Pasienter med CP / CPP rapport smerter i perineum, endetarm, prostata, penis, testikler og / eller magen 28, oppleve en hiGher grad av psykisk stress enn kontrollpasienter 29, og ofte tilstede med symptomer på eller er diagnostisert med komorbide kroniske bekkensmerter eller stemningslidelser 5,29-31. Tilbakevendende infeksjon, utett epitel, nevrogen inflammasjon og autoimmunitet har alle blitt antatt som potensielle underliggende årsaker til CP / CPP 2,32,33, samt mastcelleaktivering og degranulering 34. Uttrykt prostata sekreter fra menn med CP / CPP hadde økt mastcelle tryptase og nervevekstfaktor (NGF) nivåer 34, og en senere studie bekreftet at tryptase og karboksypeptidase A (CPA3), en markør for mastcelleaktivering, ble også økt i urin av CP / CPP pasienter 35. Den potensielle rolle for mastceller i utbruddet og vedlikehold av CP / CPP har vært et stort fokus på dyr forskning på dette syndromet så langt. Den mest vanlig anvendte gnagermodell for å studere CP / CPP er en eksperimentell autoimmun prostatitt (EAP) modell generated ved subkutan injeksjon av prostata antigen i fullstendig Freunds adjuvans, noe som resulterer i varierende grader av betennelse i prostata, avhengig av artene og stammen som brukes 34,36-39. Mastcelleinfiltrasjon og aktivering / degranulering har vist seg å øke etter induksjon av EAP 34,35,40. Transgene mus mangelfull i enten mastceller 34 eller tryptase reseptoren PAR2 35 utvikler ikke prostatahyperplasi taktikk følsomhet følgende EAP, i motsetning til hvete EAP mus. Selv om denne preklinisk modell replikerer mange av egenskapene til human CP / CPP er induksjonen protokollen ikke en indikasjon på den menneskelige tilstand, som har en mangfoldig etiologi og ofte ikke involverer direkte inflammasjon, infeksjon eller skade på prostata. Påvirkningen av tidlig liv stress på utvikling av CP / CPP hos mennesker har i stor grad gått uninvestigated; Men en studie av Hu, et al. 41, viste at megn som rapporterte en historie om barndom fysisk, følelsesmessig og / eller seksuelle overgrep var signifikant mer sannsynlig å oppleve symptomer på CP / CPP. Videre viste de at både smerte og urin skår ble økt hos pasienter med en historie med fysisk og psykisk mishandling. Vi har tidligere vist at det samme NMS paradigmet i kvinnelig C57BL / 6 mus produserer vaginal overfølsomhet og unormal genuttrykk i både vagina og urin tyder på dysfunksjonell HPA aksen utgang 16. Dette bevis kombinert med høy forekomst av CP / CPP pasienter med andre samtidige sykdommer, 42, inkludert IC / PBS og stemningslidelser, som er mer tydelig vist seg å være knyttet til tidlig liv stress eksponering 12-14, gir begrunnelsen for å bruke en NMS modell for å undersøke CP / CPP hos mus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

Kronisk prostatitt / kronisk bekkensmertesyndrom (CP / CPP) har en livstidsprevalens på 14% og er den vanligste urologisk diagnose for menn under 50 år, men det er den minst forståtte og studerte kroniske bekkensmerter lidelse. En betydelig undergruppe av pasienter med kroniske bekkensmerter rapport etter å ha opplevd tidlig liv stress eller misbruk, som kan betydelig påvirke funksjon og regulering av hypothalamus-hypofyse-binyre (HPA) aksen. Mastcelleaktivering, som har vist seg å være økt i både urin og uttrykt prostata sekreter av CP / CPP-pasienter og delvis reguleres av nedstrøms aktivering av HPA akse. Neonatal mors separasjon (NMS) har blitt brukt i over to tiår å studere resultatene av tidlig liv stress i gnagermodeller, inkludert endringer i HPA-aksen og visceral følsomhet. Her gir vi en detaljert protokoll for bruk av NMS som et preklinisk modell av CP / CPP i mannlige C57BL / 6 mus. Vi beskriver metodologifor å utføre NMS, vurdere perigenital mekanisk allodyni, og histologiske tegn på mastcelleaktivering. Vi tilbyr også bevis for at tidlig psykologisk stress kan ha langvarige effekter på mannlige urogenitale systemet hos mus.

Mus som har gjennomgått NMS viste atferds bevis indikerer CP / CPP. Når den testes med en gradert serie av von Frey monofilamenter, 8 uker gamle NMS mus (n = 4) vises perigenital mekanisk allodyni i forhold til ubehandlede motparter (n = 5, figur 2). Dette er dokumentert som en signifikant reduksjon (p &lt;0,01; Students t-test) i det mekaniske uttak terskelen som fremkalte en positiv atferdsmessig respons, registrert som en rask rykk eller hoppe i respons til monofilament anvendelse eller sl...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation at JoVE.com

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Vi måler perigenital mekanisk følsomhet og mastcelleaktivering i prostata av mannlige C57BL / 6 mus som gjennomgikk en tidlig liv stress paradigmet - neonatal mors separasjon, for å indusere en preklinisk modell av kronisk prostatitt / kronisk bekkensmertesyndrom.

Vurdering av Perigenital Sensitivity og prostatamastcelleaktivering i en musemodell for Neonatal Maternal Separation

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

A Swine Model of Neonatal Asphyxia

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

En Nasse Nøff Model of Neonatal hypoksisk-iskemisk encefalopati

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

Motor and Hippocampal Dependent Spatial Learning and Reference Memory Assessment in a Transgenic Rat Model of Alzheimer's Disease with Stroke

Motor og hippocampus Avhengig romfølelse og Reference Minne Vurdering i en transgen Rat Model of Alzheimers Disease med Stroke

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease that results in neurodegeneration and memory loss. While age is a major risk ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En Neonatal Mouse ryggmargskompresjon Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

Et batteri av Motor tester i en Neonatal Mouse Model of Cerebral Parese

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Hjerteinfarkt i Neonatal mus, en modell av Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk Contractility måling av musen hvem arterien bruker Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

En Cryoinjury modell for å studere hjerteinfarkt i Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...