Name: assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation at JoVE.com

The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Todas as experiências descritas neste protocolo estão em conformidade com as diretrizes do NIH, em conformidade com as orientações especificadas pela University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care e do Comitê Use. 1. Separação Materna Neonatal (SMN) <ol><li> Monitorar barragens grávidas diariamente para nascimentos de maca. Nota: O dia da ninhada nasce é considerado P0. </li><li> No P1, retire a barragem da gaiola e coloque em um recipiente secundário limpo....

Este protocolo fornece metodologia para usar o estresse neonatal, sob a forma de NMS, para induzir a sintomatologia indicativa de CP / CPPS em ratos machos adultos. Como adultos, os ratos NMS exibir alodinia mecânica perigenital significativa, bem como provas de degranulação dos mastócitos no tecido da próstata. O uso de NMS é uma nova abordagem para o desenvolvimento de um modelo pré-clínico da CP / CPPS na medida em que reproduz o início da vida stress que muitas vezes é relatada pelos pacientes com dor pél...

A dor pélvica crônica não é em si uma doença, mas sim um termo associado com a dor espontânea em curso e / ou evocado experimentado por pacientes com diagnóstico de síndrome do intestino irritável (IBS), cistite / síndrome da bexiga dolorosa intersticial (IC / PBS), vulvodynia, ou síndrome de prostatite crônica / dor pélvica crônica (CP / CPPS). Estas síndromes são frequentemente comorbidade e partilham muitas características em que eles não têm qualquer patologia associada ou etiologia subjacente identificado, embora a disfunção no sistema imunológico, sistema nervoso central, sistema nervoso periférico e tem sido demonstrado que contribuem para a manutenção e a progressão dessas doenças 1 -3. Os pacientes com dor pélvica crónica são mais propensos a apresentar sintomas de adicional, não-relacionadas distúrbios de dor pélvica funcionais e transtornos de humor, incluindo a ansiedade, depressão, distúrbios de pânico e 4-6, que tem sido associado com a funcionamento alterado do hipotálamo hipófiseadrenal (HPA) 7-10. A exposição ao estresse precoce ou trauma é um importante fator de risco para o desenvolvimento de anormalidades HPA e síndromes de dor crônica associados 10,11 e, como tal, um subconjunto significativo de pacientes com transtornos de dor pélvica funcionais relatam ter experimentado efeitos adversos da infância, como abuso ou negligência 12-14. Modelos de roedores de separação materna neonatal (SMN), que envolve a remoção os filhotes de suas mães por um determinado período de tempo durante o período de pré-desmame, foram utilizados para as últimas duas décadas a estudar os resultados de estresse precoce. Em geral, a NMS foi mostrada para aumentar a ativação do eixo HPA, e comportamentos de ansiedade semelhante resultantes, afectando directamente a expressão de genes dentro do hipotálamo, bem como perturbando a regulação a jusante a partir de estruturas límbicas 15-18. Perturbação de funcionamento correcto do eixo HPA foi mostrado para contribuir para o aumento da colorrectal 19-22 </sup&gt; Vaginal e 16 sensibilidade apresentada por roedores NMS modelos, mas, apesar de extensa caracterização do efeito a longo prazo de inflamação da bexiga pós-natal 23-25, o impacto do estresse precoce foi amplamente ido unstudied nos órgãos urogenitais. Portanto, o estudo a seguir descrevem como executar NMS em ratos e, posteriormente, avaliar a sensibilidade mecânica perigenital e infiltração de mastócitos / activação na próstata para validar o uso de camundongos machos NMS como um modelo pré-clínico para CP / CPPS. De todos os distúrbios da dor pélvica crônica diagnosticada, CP / CPPS é talvez a síndrome menos bem reconhecido e caracterizado, apesar de ter uma prevalência de cerca de 14% 26 e custos anuais de doentes estimados em 4,400 dólares (o dobro da dor lombar ou artrite artrite 27). Os pacientes com CP relatório / CPPS dor no períneo, reto, próstata, pênis, testículos, e / ou abdômen 28, experimentar um oigher grau de estresse psicológico do que os pacientes de controle 29, e comumente presentes com sintomas de ou são diagnosticados com dor ou transtornos de humor pélvicas crônicas de comorbidade 5,29-31. Infecção recorrente, epitélio com goteiras, inflamação neurogênica, e autoimunidade têm sido imaginado como potenciais causas subjacentes da CP / CPPS 2,32,33, assim como a ativação de mastócitos e degranulation 34. Secreções prostáticas expressa a partir de homens com CP / CPPS tinha aumentado triptase de mastócitos e factor de crescimento do nervo (NGF), os níveis 34, e um estudo mais tarde confirmado que a triptase e carboxipeptidase A (CPA3), um marcador de activação de mastócitos, foram também aumentadas no urina de pacientes com CP / CPPS 35. O papel potencial de mastócitos no início e manutenção da CP / CPPS tem sido um importante foco de pesquisas com animais sobre essa síndrome até agora. O modelo de roedor mais comumente empregado usado para estudar CP / CPPS é uma prostatite auto-imune experimental (EAP) modelo genrado pela injecção subcutânea do antigénio da próstata em adjuvante completo de Freund, o que resulta em graus variados de inflamação prostática dependendo das espécies e estirpes utilizadas 34,36-39. Infiltração de mastócitos e ativação / desgranulação foi mostrado para aumentar após a indução da EAP 34,35,40. Camundongos transgênicos deficientes em ambos os mastócitos 34 ou o receptor tryptase PAR2 35 não desenvolver a sensibilidade tática prostática seguinte EAP, ao contrário de ratos do tipo selvagem EAP. Embora este modelo pré-clínico replica muitas das características de PB humano / CPPS, o protocolo de indução não é indicativo da condição humana, que tem uma etiologia diversa e muitas vezes não envolvem inflamação directa, infecção ou lesão da próstata. A influência do estresse precoce no desenvolvimento de CP / CPPS em seres humanos foi amplamente ido sem investigação; no entanto, um estudo realizado por Hu et al. 41, demonstrou que men que relatou uma história de infância físico, emocional e / ou abuso sexual foram significativamente mais propensos a apresentar sintomas sugestivos de CP / CPPS. Além disso, eles mostraram que tanto a dor e escores urinários foram aumentados em pacientes com história de abuso físico e emocional. Nós já demonstrado que o mesmo paradigma NMS em fêmea C57BL / 6 ratos produz hipersensibilidade vaginal e a expressão do gene anormal tanto na vagina e bexiga sugestivo de HPA disfuncional eixo de saída 16. Esta evidência combinada com a alta prevalência de CP / CPPS pacientes que apresentam outras comorbidades 42, incluindo IC / PBS e transtornos de humor, que foram mais claramente demonstrado que é relacionada com a exposição estresse precoce 12-14, fornece a justificativa para o uso de um modelo NMS para investigar CP / CPPS em camundongos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

Prostatite crônica / síndrome de dor pélvica crônica (CP / CPPS) tem uma prevalência de 14% e é o diagnóstico urológico mais comum entre homens com idade inferior a 50, no entanto, é a desordem de dor pélvica crônica menos compreendidas e estudadas. Um subconjunto significativo de pacientes com dor pélvica crônica relatório ter experimentado estresse precoce ou abuso, que pode afetar significativamente o funcionamento ea regulação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA). Activação de mastócitos, que se demonstrou ser aumentada na urina e expresso de secreções prostáticas doentes CP / CPPS, é parcialmente regulado por activação a jusante do eixo HPA. Neonatal separação materna (SMN) tem sido usado por mais de duas décadas a estudar os resultados de estresse precoce em modelos de roedores, incluindo alterações no eixo HPA e sensibilidade visceral. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a utilização NMS como um modelo pré-clínico da CP / CPPS em machos C57BL / 6. Nós descrevemos a metodologiapara a realização de NMS, avaliando a alodinia mecânica perigenital, e evidência histológica de ativação de mastócitos. Nós também fornecemos evidências de que o estresse psicológico precoce pode ter efeitos duradouros sobre o sistema urogenital masculina em ratos.

Os ratos que foram submetidos a NMS mostrou evidências comportamentais indicativo de CP / CPPS. Quando testado com uma série graduada de monofilamentos de von Frey, 8 semanas de idade, ratinhos NMS (n = 4) exibido alodinia mecânica perigenital quando comparado com homólogos naive (n = 5, Figura 2). Isto é evidenciado como uma redução significativa (p &lt;0,01; teste t de Student) no limiar mecânico de retirada que provocou uma resposta comportamental positiva, registrado como um empurr?...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Estamos medindo a sensibilidade ea ativação de células mastro mecânico perigenital na próstata masculina de camundongos C57BL / 6 que foram submetidos a um paradigma de estresse precoce - separação materna neonatal, de modo a induzir um modelo pré-clínico de síndrome de dor pélvica / crônica prostatite crônica.

Avaliação da Perigenital Sensibilidade e Prostatic Mast Ativação celular em um rato modelo de Separação Materna Neonatal

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