Name: assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation at JoVE.com

The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Todos los experimentos descritos en este protocolo se ajustan a las directrices del NIH de conformidad con las directrices especificadas por la Universidad de Kansas Medical Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. 1. Separación Materno Neonatal (SMN) <ol><li> Monitorear las presas embarazadas diaria para los nacimientos de basura. Nota: El día de la camada nace se considera P0. </li><li> En P1, retire la presa de la jaula y coloque en un recipiente secundar...

Este protocolo proporciona la metodología para el uso de estrés neonatal, en forma de NMS, para inducir sintomatología indicativa de CP / CPPS en ratones machos adultos. Como adultos, los ratones muestran NMS alodinia mecánica perigenital significativa, así como pruebas de desgranulación de los mastocitos en el tejido prostático. El uso de NMS es un nuevo enfoque para el desarrollo de un modelo preclínico de CP / CPPS en que replica el estrés de la vida temprana que a menudo se informó por los pacientes con do...

El dolor pélvico crónico no es en sí una enfermedad, sino más bien un término asociado con el dolor continuo espontáneo y / o evocado que sufren los pacientes con diagnóstico de síndrome de intestino irritable (SII), cistitis / síndrome de vejiga dolorosa intersticial (IC / PBS), la vulvodinia, o el síndrome de dolor pélvico prostatitis crónica / crónica (CP / CPPS). Estos síndromes son a menudo comórbida y comparten muchas características en que no tienen ninguna patología asociada o etiología subyacente identificado, aunque la disfunción en el sistema inmunológico, sistema nervioso central, sistema nervioso periférico y se ha demostrado que contribuyen al mantenimiento y la progresión de estos trastornos 1 -3. Los pacientes con dolor pélvico crónico son más propensos a presentar síntomas de adicional, trastornos de dolor funcionales y trastornos del estado de ánimo, incluyendo la ansiedad, la depresión y el trastorno de pánico 4-6, que se ha asociado con el funcionamiento alterado de la hipotálamo no relacionados con pélvico- pituitarioadrenal (HPA) 7-10. La exposición al estrés de la vida temprana o trauma es un factor de riesgo importante para el desarrollo de anomalías HPA y asociados síndromes de dolor crónico 10,11 y, como tal, un subconjunto significativo de pacientes con trastornos de dolor pélvico funcionales reportan haber experimentado eventos adversos de la infancia como el abuso o negligencia 12-14. Modelos de roedores de la separación materna neonatal (SMN), que consiste en la eliminación de las crías de su presa por un período determinado de tiempo durante el período predestete, se han utilizado durante las últimas dos décadas a estudiar los resultados del estrés de la vida temprana. En general, NMS se ha demostrado que aumenta la activación del eje HPA, y comportamientos similares a la ansiedad resultantes, afectando directamente la expresión génica en el hipotálamo, así como la interrupción de la regulación aguas abajo de las estructuras límbicas 15-18. La interrupción de funcionamiento adecuado del eje HPA se ha demostrado que contribuyen a una mayor colorrectal 19-22 </sup&gt; Y vaginal 16 sensibilidad representada por los modelos NMS roedores, pero a pesar de una amplia caracterización de los efectos a largo plazo de la inflamación de la vejiga después del parto 23-25, el impacto del estrés primeros años de vida ha pasado casi sin estudiar en los órganos urogenitales. Por lo tanto, el siguiente estudio describe cómo realizar NMS en ratones y posteriormente evaluar la sensibilidad mecánica perigenital y la infiltración de mastocitos / activación en la próstata para validar el uso de ratones NMS masculinos como un modelo preclínico para CP / CPPS. De todos los trastornos de dolor pélvico crónico diagnosticados, CP / CPPS es tal vez el síndrome de menos bien reconocida y caracterizada, a pesar de tener una prevalencia de aproximadamente el 14% 26 y los costos anuales de pacientes estimados en $ 4,400 (el doble que el de la lumbalgia o reumatoide artritis 27). Los pacientes con CP / CPPS informe dolor en el perineo, el recto, próstata, pene, testículos, y / o el abdomen 28, experimentan una altagrado gher de estrés psicológico que los pacientes de control 29, y por lo general se presentan con síntomas de o son diagnosticados con el dolor o el estado de ánimo trastornos pélvicos crónicos comórbidas 5,29-31. Infección recurrente, el epitelio que gotea, inflamación neurogénica, y autoinmunidad han sido conjeturado como posibles causas subyacentes de la CP / CPPS 2,32,33, así como la activación de los mastocitos y degranulación 34. Las secreciones prostáticas expresadas a partir de los hombres con CP / CPPS habían aumentado los niveles de triptasa de mastocitos y factor de crecimiento nervioso (NGF) 34, y un estudio posterior confirmado que la triptasa y carboxipeptidasa A (CPA3), un marcador de la activación de los mastocitos, también se incrementaron en el orina de pacientes CP / CPPS 35. El papel potencial de los mastocitos en el inicio y mantenimiento de la CP / CPPS ha sido un foco importante de la investigación con animales en este síndrome hasta el momento. El modelo de roedor más comúnmente empleada utilizado para estudiar CP / CPPS es una prostatitis autoinmune experimental (EAP) modelo de generaciónnerada por inyección subcutánea de antígeno de próstata en adyuvante completo de Freund, lo que resulta en variados grados de inflamación prostática dependiendo de la especie y cepa utilizada 34,36-39. Infiltración de células de mástil y la activación / desgranulación se ha demostrado que aumenta después de la inducción de la PEA 34,35,40. Los ratones transgénicos deficientes en cualquiera de los mastocitos 34 o el receptor de triptasa PAR2 35 no desarrollan la sensibilidad táctica prostática siguiente EAP, a diferencia de los ratones de tipo salvaje de EAP. Si bien este modelo preclínico replica muchas de las características del CP humana / CPPS, el protocolo de inducción no es indicativo de la condición humana, que tiene una etiología diversa y muchas veces no implica inflamación directa, infección o lesión de la próstata. La influencia del estrés de la vida temprana en el desarrollo de CP / CPPS en los seres humanos en gran medida ha ido sin investigar; Sin embargo, un estudio realizado por Hu, et al. 41, demostró que men que reportaron una historia de la infancia física, emocional y / o abuso sexual fueron significativamente más propensos a experimentar síntomas sugestivos de CP / CPPS. Además, demostraron que tanto el dolor y las puntuaciones urinarios se incrementaron en los pacientes con antecedentes de abuso físico y emocional. Hemos demostrado anteriormente que el mismo paradigma NMS en hembra C57BL / 6 ratones produce hipersensibilidad vaginal y la expresión génica anormal tanto en la vagina y la vejiga sugestivo de HPA disfuncional eje de salida 16. Esta evidencia combinada con la alta prevalencia de pacientes CP / CPPS que presentan otras comorbilidades 42, incluyendo IC / PBS y los trastornos del estado de ánimo, que más claramente han demostrado estar relacionado con la exposición al estrés de la vida temprana 12-14, proporciona la justificación para el uso de un modelo NMS para investigar CP / CPPS en ratones.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

La prostatitis crónica / síndrome de dolor pélvico crónico (CP / CPPS) tiene una prevalencia de vida del 14% y es el diagnóstico urológico más común para los hombres menores de 50, sin embargo, es el trastorno de dolor pélvico crónico menos comprendido y estudiado. Un subconjunto significativo de pacientes con dolor pélvico crónico reporte haber experimentado estrés de la vida temprana o abuso, lo que puede afectar notablemente el funcionamiento y la regulación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA). Activación de los mastocitos, que se ha demostrado ser aumentado tanto en orina y expresó secreciones prostáticas de pacientes CP / CPPS, está parcialmente regulada por la activación aguas abajo del eje HPA. Separación materna neonatal (SNM) se ha utilizado durante más de dos décadas a estudiar los resultados del estrés de la vida temprana en modelos de roedores, incluyendo cambios en el eje HPA y la sensibilidad visceral. Aquí le ofrecemos un protocolo detallado para el uso de NMS como un modelo preclínico de CP / CPPS en machos C57BL / 6 ratones. Se describe la metodologíapara la realización de NMS, la evaluación de la alodinia mecánica perigenital, y evidencia histológica de activación de los mastocitos. También proporcionamos evidencia de que el estrés psicológico temprana puede tener efectos a largo plazo sobre el sistema urogenital masculina en ratones.

Los ratones que han sido sometidos a NMS mostró evidencia de comportamiento indicativos de CP / CPPS. Cuando se prueba con una serie graduada de monofilamentos de von Frey, ratones NMS 8 semanas de edad (n = 4) que se muestra la alodinia mecánica perigenital en comparación con homólogos no tratados (n = 5, Figura 2). Esto se evidencia como una reducción significativa (p &lt;0,01; prueba t de Student) en el umbral de retirada mecánica que provocó una respuesta de comportamiento positivo, ...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Estamos midiendo la sensibilidad y la activación de las células mástil mecánica perigenital en la próstata de macho C57BL / 6 ratones que se sometieron a un paradigma principios de estrés de la vida - la separación materna neonatal, con el fin de inducir un modelo preclínico de síndrome de dolor pélvico / crónica prostatitis crónica.

Evaluación de perigenital Sensibilidad y Prostática mástil activación celular en un modelo de ratón de la separación materna neonatal

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