Name: assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation at JoVE.com

The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Alla försök som beskrivs i detta protokoll överensstämmer med NIH riktlinjer i enlighet med de riktlinjer som anges av University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care och användning kommittén. 1. Neonatal Maternal Separation (NMS) <ol><li> Övervaka gravida dammar dagligen för kull födda. Obs: Dagen kullen föds anses P0. </li><li> På P1, ta bort dammen från buren och placera i en ren sekundära behållaren. </li><li> Gnid en handfull strö mellan rena-handsk...

Detta protokoll ger metodik för användning av neonatal stress i form av NMS, att inducera symptomologi indikerar CP / CPP hos vuxna hanmöss. Som vuxna, de NMS möss uppvisar betydande perigenital mekanisk allodyni, samt bevis på mastcelldegranulering i prostatavävnad. Användningen av NMS är ett nytt sätt att utveckla en preklinisk modell av CP / CPP att det replikerar tidiga liv stress som ofta rapporteras av patienter med kronisk bäckensmärta 12-14, samt att införliva en icke-invasiv induktion, so...

Kronisk bäckensmärta är inte i sig en sjukdom, utan snarare ett begrepp i samband med den pågående spontan och / eller framkallade smärta upplevs av patienter som diagnostiserats med colon irritabile (IBS), interstitiell cystit / smärtsam blåsa (IC / PBS), vulvodynia, eller kronisk prostatit / kronisk bäckensmärta syndrom (CP / CPP). Dessa syndrom är ofta samtidiga och delar många egenskaper genom att de inte har någon tillhörande patologi eller identifieras underliggande etiologi, men dysfunktion i immunsystemet, det centrala nervsystemet och perifera nervsystemet har visat sig bidra till att bevara och utvecklingen av dessa sjukdomar 1 -3. Patienter med kronisk bäckensmärta är mer benägna att uppvisa symptom på ytterligare, icke-bäckenet relaterade funktionella smärttillstånd och humörstörningar, inklusive ångest, depression och panikångest 4-6, som har satts i samband med förändrad funktion hypothalamic- hypofysadrenal (HPA) axel 7-10. Exponering för tidiga liv stress eller trauma är en betydande riskfaktor för att utveckla HPA avvikelser och tillhörande kroniska smärtsyndrom 10,11 och, som sådan, rapporterar en betydande undergrupp av patienter med funktionella bäckensmärttillstånd ha upplevt negativa barndom händelser såsom övergrepp eller försummelse 12-14. Gnagare modeller av neonatal maternal separation (NMS), vilket innebär att ta bort valparna från sin mor under en viss tid under preweaning perioden, har använts under de senaste två decennierna för att studera resultaten av tidiga liv stress. I allmänhet, har NMS visats öka HPA-axeln aktivering och resulterande ångestliknande beteenden, genom att direkt påverka genuttryck i hypotalamus, samt störa nedströms reglering från limbiska strukturer 15-18. Störningar av korrekt HPA-axeln funktion har visat sig bidra till ökad kolorektal 19-22 </sup&gt; Och vaginal 16 känslighet visas av gnagare NMS modeller, men trots omfattande karakterisering av den långsiktiga effekten av postnatal inflammation i urinblåsan 23-25, har effekterna av tidiga liv stressen till stor del gått unstudied i urogenitalorganen. Därför kommer följande studie beskriver hur man utför NMS hos möss och senare utvärdera perigenital mekanisk känslighet och mastcellinfiltration / aktivering i prostatan att kontrollera användningen av manliga NMS möss som en preklinisk modell för CP / CPP. Av alla de diagnostiserade kroniska bäckensmärttillstånd, är CP / CPP kanske minst välkänt och kännetecknas syndrom, trots att de har en livstidsprevalens på cirka 14% 26 och årliga patientens kostnader uppskattas till $ 4400 (dubbelt så stor som ländryggssmärta eller reumatoid artrit 27). Patienter med CP / CPP rapport smärta i mellangården, ändtarm, prostata, penis, testiklar, och / eller buk 28, uppleva en hiGher grad av psykisk stress än kontrollpatienter 29, och vanligt förekommande med symtom på eller diagnostiseras med comorbid kronisk bäckensmärta eller humörstörningar 5,29-31. Återkommande infektion, läckande epitel, neurogen inflammation och autoimmunitet har alla surmised som potentiella bakomliggande orsaker till CP / CPP 2,32,33, samt mastcellsaktivering och degranulering 34. Uttryckt prostatasekret från män med CP / CPP hade ökat mastcells tryptas och nervtillväxtfaktor (NGF) nivåer 34, och en senare studie bekräftade att tryptas och karboxipeptidas A (CPA3), en markör för mastcellsaktivering, har också ökat i urin av CP / CPP patienter 35. Den potentiella roll mastceller i uppkomsten och upprätthållandet av CP / CPP har varit ett stort fokus för djurförsök på detta syndrom hittills. Den vanligast användes gnagarmodell används för att studera CP / CPP är en experimentell autoimmun prostatit (EAP) modell allmbetade genom subkutan injektion av prostata antigen i fullständigt Freunds adjuvans, vilket resulterar i varierande grader av prostatainflammation beroende på art och stam som används 34,36-39. Mast cellinfiltration och aktivering / degranulering har visat sig öka efter induktion av EAP 34,35,40. Transgena möss som saknar antingen mastceller 34 eller tryptas receptorn PAR2 35 utvecklar inte prostata taktik känslighet efter EAP, till skillnad från vildtyp EAP möss. Även om detta preklinisk modell replikerar många av de egenskaper hos mänskliga CP / CPP, är induktionsprotokollet inte ett tecken på människans villkor, som har ett mångsidigt etiologi och ofta inte innebär direkt inflammation, infektion eller skada prostatan. Inverkan av tidiga liv stress på utvecklingen av CP / CPP hos människa har till stor del gått undersöks inte; Men en studie av Hu et al. 41, visade att mign som rapporterade en historia av barndomen fysiska, känslomässiga och / eller sexuella övergrepp var betydligt mer benägna att uppleva symtom som tyder på CP / CPP. Dessutom visade de att både smärta och urin poäng var förhöjd hos patienter med en historia av fysisk och psykisk misshandel. Vi har tidigare visat att samma NMS paradigm i C57BL / 6-möss producerar vaginala överkänslighet och onormal genexpression i både slidan och urinblåsan tyder på dysfunktionell HPA-axeln utgång 16. Detta bevis i kombination med den höga förekomsten av CP / CPP patienter med andra sjukdomstillstånd 42, inklusive IC / PBS och humörstörningar, som tydligare har visat sig vara kopplat till tidiga liv spännings exponering 12-14, ger grunden för att använda en NMS modell för att undersöka CP / CPP i möss.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

Kronisk prostatit / kronisk bäckensmärta syndrom (CP / CPP) har en livstidsprevalens på 14% och är den vanligaste urologiska diagnos för män under 50 års ålder, men det är den minst förstådda och studerade kronisk bäckensmärta sjukdom. En betydande undergrupp av patienter med kronisk bäckensmärta rapport ha upplevt tidiga liv stress eller missbruk, som markant kan påverka funktion och reglering av hypotalamus-hypofys-binjure (HPA) axel. Mastcellaktivering, vilket har visat sig öka i både urin och uttryckta prostatasekre av CP / CPP-patienter, är delvis regleras genom nedströms aktivering av HPA-axeln. Neonatal moderns separation (NMS) har använts i över två decennier att studera resultaten av tidiga liv stress i gnagarmodeller, inklusive förändring i HPA-axeln och visceral känslighet. Här ger vi ett detaljerat protokoll för att använda NMS som en preklinisk modell av CP / CPP i manliga C57BL / 6-möss. Vi beskriver metodikenför utförande av NMS, bedöma perigenital mekanisk allodyni, och histologiska tecken på mastcellaktivering. Vi tillhandahåller också belägg för att tidigt psykisk stress kan ha långvariga effekter på den manliga urogenitala systemet hos möss.

Möss som har genomgått NMS visade beteende bevis tyder på CP / CPP. Vid testning med en graderad serie av von Frey monofilament, 8 veckor gamla NMS möss (n = 4) visas perigenital mekanisk allodyni jämfört med naiva motsvarigheter (n = 5, fig 2). Detta framgår som en signifikant minskning (p &lt;0,01, t-test) i den mekaniska återtagströskel som framkallade en positiv beteende svar, redovisas som en rask ryck eller hoppa som svar på monofilament ansökan eller slickar eller bitande bete...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation at JoVE.com

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Vi mäter perigenital mekanisk känslighet och mastcellsaktivering i prostatan manliga C57BL / 6 möss som genomgick en tidig livet stressen paradigm - neonatal maternal separation, i syfte att förmå en preklinisk modell av kronisk prostatit / kronisk bäckensmärtsyndrom.

Bedömning av Perigenital känslighet och prostata Mast cellsaktivering i en musmodell av neonatal Maternal Separation

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

En musmodell av I livmodern Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-photon avbildning av tumörcellen invasion i ett Orthotopic musmodell av oral skivepitelcancer

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

A Swine Model of Neonatal Asphyxia

Ett svin modell av neonatal asfyxi

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

En Piglet Modell av neonatal hypoxisk-ischemisk encefalopati

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

Motor and Hippocampal Dependent Spatial Learning and Reference Memory Assessment in a Transgenic Rat Model of Alzheimer's Disease with Stroke

Motor och hippocampus Beroende spatial inlärning och referens minne bedömning i en transgen råttmodell av Alzheimers sjukdom med Stroke

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease that results in neurodegeneration and memory loss. While age is a major risk ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En neonatal mus ryggmärgskompression skada Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

Ett batteri av motoriska test i en neonatal musmodell av cerebral pares

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Hjärtinfarkt i neonatala möss, en modell av Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet mätning av mus mesenterica artär med Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

En Kryoskademodell för att studera hjärtinfarkt i mus

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...