Name: studying the stoichiometry of epidermal growth factor receptor in intact cells using correlative microscopy
Uploaded: 2015-09-11T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy at JoVE.com

We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.

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	<li>Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+microscopy+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum-dot-labeled+proteins+in+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid.</a> ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).</li><li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film.">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).</li><li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy.">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).</li><li>Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution.">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy:+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells.">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+subunit+locations+determined+in+hydrated+cells+with+environmental+scanning+electron+microscopy.">Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy.</a> Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).</li><li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence-+and+liquid+electron+microscopy.">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. under revision, (2015).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).</li><li>Herbst, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+epidermal+growth+factor+receptor+biology.">Review of epidermal growth factor receptor biology.</a> Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).</li><li>Normanno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+signaling+in+cancer.">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366, 2-16 (2006).</li><li>Hofman, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+coalescence+of+different+lipid+rafts.">EGF induces coalescence of different lipid rafts.</a> J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).</li><li>Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+raft+localization+of+EGFR+alters+the+response+of+cancer+cells+to+the+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+gefitinib.">Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib.</a> J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).</li><li>Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane-associated+proteins+are+clustered+into+islands+attached+to+the+cytoskeleton.">Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).</li><li>Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneities+in+EGF+receptor+density+at+the+cell+surface+can+lead+to+concave+up+scatchard+plot+of+EGF+binding.">Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding.</a> FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).</li><li>Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+organization+of+ErbB+receptors:+insights+from+microscopy.">The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, (2014).</li><li>Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence-+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+and+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).</li><li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells.">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li><li>Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet+STEM:+A+new+development+in+environmental+SEM+for+imaging+nano-objects+included+in+a+liquid+phase.">Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase.</a> Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).</li><li>Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells.">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464, 783-787 (2010).</li><li>Stoyan, D., Stoyan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+pair+correlation+functions+of+planar+cluster+processes.">Estimating pair correlation functions of planar cluster processes.</a> Biom. J. 38, 259-271 (1996).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tumor-targeted+fluorescence+imaging+using+near-infrared+non-cadmium+quantum+dots.">In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots.</a> Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Warren, C. M., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+ERBB+receptors:+Multiple+layers+of+diversity+and+control.">Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control.</a> Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).</li><li>Hoenger, A., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+macromolecular+organization+of+cells+by+electron+tomography.">Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).</li><li>Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. 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H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+quantification+of+amino+acids+and+proteins+in+complex+subcellular+compartments.">Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments.</a> Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).</li><li>Orlov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+immunogold+labelling+of+RNA+polymerase.">Live cell immunogold labelling of RNA polymerase.</a> II. Sci. Rep. 5, 8324 (2015).</li><li>Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clustering+of+the+B+cell+antigen+receptor+demonstrated+by+mathematically+extended+electron+microscopy.">Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy.</a> Front. Immunol. 4, 427 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;étude de la distribution spatiale et la stoechiométrie des protéines membranaires, comme l&#39;EGFR, dans des cellules entières de contexte fournit des informations importantes sur sa fonction d&#39;éventuelles modifications de ceux-ci et de 11 à 14. Il est difficile d&#39;étudier la distribution des monomères, des dimères, et des grappes directement sur ​​un niveau sous-cellulaire en utilisant des procédés biochimiques couramment utilisés, pour lesquels l&#39;information est perdue sur la localisation de la protéine dans la cellule ou les cellules de 15 différences entre les. Les méthodes de marquage décrites ici microscopie et permettent la visualisation des complexes protéiques sur une échelle de longueur de quelques nanomètres de sorte que sa stoechiométrie peut être étudiée dans le contexte de cellules intactes individuelles, 4-7. Cela ne veut pas possible avec (résolution super) de microscopie optique 23 car la résolution est insuffisante pour distinguer les molécules engagées dans un complexe protéique. Transfert Förster Resonance Energy (FRET) est une technique de moyenne d&#39;ensemble &lt;sup&gt; 24, et ne détecte pas nécessairement les dimères et plus grappes de commande comme une conséquence de la courte portée de transfert d&#39;énergie 25. Dosages de ligature de proximité 26 ne mesurent pas les distances et ne sont donc pas capables de distinguer entre une région cellulaire avec une densité élevée en protéines, inévitablement conduit à un certain nombre de proximités détecté par hasard, à partir d&#39;une région cellulaire avec une densité de protéine similaire, mais contenant des protéines complexes présentant des distances distinctes entre les étiquettes. La haute résolution nécessaire pour visualiser les constituants de complexes de protéines est obtenue en microscopie électronique à transmission (MET). Cependant, TEM classique de cellules entières est limitée par l&#39;exigence de minces échantillons / sections de tranchage à travers la membrane 27 plasmatique, ou plasma membrane de rupture ou de déchirure de 28,29 formées au hasard résultant en petits morceaux de membrane. La membrane plasmique est donc pas imagé dans son ensemble, ce qui conduit à un manqued&#39;éventuellement cruciale informations de contexte cellulaire. D&#39;autres difficultés expérimentales pour l&#39;étude de la protéine dans les cellules stoechiométrie proviennent de la protéine de marquage appliquée. Communément immunomarquage utilisé porte la difficulté que l&#39;un-à-un entre le récepteur et la stoechiométrie étiquette ne peut être obtenu avec une sonde d&#39;monovalent; ceci est pas le cas lorsque les anticorps primaires et secondaires sont nécessaires. Pour obtenir des informations sur la stoechiométrie de la protéine, il est nécessaire que la sonde se lie à un epitope unique sur le récepteur et dispose d&#39;un site de liaison pour une sonde fluorescente ou un numéro atomique élevé nanoparticule de l&#39;autre côté. En second lieu, la précision obtenue avec l&#39;anticorps étiquetage est limitée en raison de leur grande taille 30 à 30 nm, de sorte qu&#39;une discrimination entre les protéines voisines simples, des homodimères ou des grandes grappes est impossible, du moins pour les récepteurs de la famille des EGFR. Beaucoup de petites étiquettes spécifiques sont connus dans la littérature et can être appliquée même pour l&#39;étiquetage intracellulaire 31 mais ceux qui ne sont pas couramment utilisés. La longueur de l&#39;ensemble étiquette (EGF-biotine-streptavidine-QD) est d&#39;une dimension similaire à celle du EGFR, et suffisamment petit pour être en mesure de détecter le dimère. En outre, la procédure en deux étapes d&#39;étiquetage décrit éviter l&#39;étiquetage induit regroupement des récepteurs. Notre méthode est pas très difficile, pas beaucoup plus que la microscopie de fluorescence de protéines marquées. Toutefois, un essai doit être effectué avec beaucoup de soin, étant donné que le nombre d&#39;étapes et ajoute une erreur dans l&#39;une des étapes peut conduire à un échec total dans l&#39;expérience. Manipulation des micropuces est pas plus fastidieux que la manipulation des réseaux TEM mais certaines puces vides de formation est recommandée. ESEM-STEM des cellules hydratées entiers est probablement l&#39;aspect le plus difficile, et nécessite au moins un opérateur qualifié et plusieurs jours de pratique afin de parvenir à une résolution d&#39;environ 3 nm comme nécessaire pour visualiser les points quantiques. Radiation barrageâge de l&#39;échantillon objet de l&#39;enquête présente un risque. La pression et la température doivent être soigneusement surveillés pour maintenir une couche d&#39;eau. En outre, l&#39;épaisseur de la couche d&#39;eau peut varier entre les cellules. Il est recommandé de surveiller la présence de la couche d&#39;eau à l&#39;aide du détecteur d&#39;électrons gazeux au-dessus de l&#39;échantillon, comme décrit par ailleurs 6. Régions cellulaires ne devraient être imagées une ou deux fois pour éviter des dommages. Une limitation essentielle du procédé est que l&#39;information à haute résolution sur l&#39;ultrastructure est absent. D&#39;autres techniques, par exemple, cryo TEM, sont nécessaires pour étudier la structure de la protéine, et l&#39;ultrastructure cellulaire 15. Deuxièmement, l&#39;étude de l&#39;interaction dynamique d&#39;un multiple de protéines dans des cellules vivantes en time-lapse microscope est pas possible en raison de dommages de rayonnement, et nécessite l&#39;état de l&#39;art de la microscopie optique 23. Actuellement, notre procédé est pas capable de déterminer le niveau absolu de dimères depuis le lAbeling efficacité est inconnue, mais nous nous attendons à ajouter ces données à l&#39;avenir. Il est néanmoins possible de dire si les dimères sont présents ou non. De la littérature est-elle connue, que même une efficacité de marquage d&#39;environ 15% est suffisante pour détecter des dimères avec une signification statistique suffisante 32. Il est facilement possible d&#39;étudier d&#39;autres récepteurs membranaires par l&#39;intermédiaire de leur ligand, par fragments Fab biotinylé d&#39;anticorps spécifiques, ou par d&#39;autres petits groupes de liaison 7 en utilisant le protocole d&#39;étiquetage en deux étapes décrit. Comme nous avons déjà démontré que deux couleurs différentes (tailles) de points quantiques peuvent être utilisés, et l&#39;étiquetage des nanoparticules d&#39;or a été utilisé dans le travail avant 6, il semble possible d&#39;étiqueter les espèces de protéines multiples dans la même expérience. Le principal défi pour l&#39;étude de la stoechiométrie des espèces protéiques multiples est d&#39;assurer une efficacité de marquage similaire pour les deux espèces ou au moins une normalisation de la stoechiométrie relative obtenue sur le respective efficacité en matière d&#39;étiquetage. Pourtant, les deux boîtes quantiques différents utilisés dans cette étude ne semblent pas différer beaucoup de l&#39;efficacité de l&#39;étiquetage (voir les figures 2 et 4). La méthode décrite impliquant étiquetage en deux étapes avec des points quantiques, et la microscopie par fluorescence et corrélative ESEM-STEM présente une méthode viable pour étudier l&#39;interaction complexe de protéines membranaires dans les membranes plasmiques intactes de cellules entières.

Une nouvelle approche a été introduite récemment, à des cellules entières d&#39;image avec des protéines marquées à l&#39;état liquide à l&#39;aide STEM 1-3, ou la microscopie de fluorescence corrélative et la tige 4-7. Cette méthodologie est capable d&#39;étudier la répartition spatiale des protéines membranaires et des protéines, y compris des complexes de leur stoechiométrie au niveau de la molécule unique dans les membranes plasmiques de cellules entières intactes. Ici, nous décrivons un protocole impliquant un étiquetage spécifique en deux étapes de protéines réceptrices avec des points quantiques fluorescents (QD) 8, et la microscopie optique et corrélative ESEM-STEM. A titre d&#39;exemple, nous avons étudié l&#39;EGFR, une protéine membranaire qui appartient à la superfamille de la protéine kinase. Lors de la liaison ligand, le récepteur active, puis forme un dimère avec un autre EGFR activé; la cascade de signaux ultérieure entraîne la prolifération des cellules 9. Des mutations conduisant à l&#39;expression de l&#39;EGFR ou activité anormale jouent un rôle central dans de nombreux types de cancer 10. StudyIng l&#39;agencement spatial de ce récepteur membranaire dans des cellules entières de contexte fournit des informations importantes sur sa fonction d&#39;éventuelles modifications de ceux-ci et de 11 à 14. Mais il reste difficile de sonder la répartition des monomères de l&#39;EGFR, dimères, et les grappes directement sur ​​un niveau (sous-) cellulaire avec des méthodes de microscopie biochemical- ou conventionnelles 15. Notre méthode est capable de visualiser EGFR avec une résolution spatiale de quelques nanomètres telles que la localisation des protéines dans un complexe peut être déterminée. Plus important encore, les informations obtenues sur la distribution stoechiométrique se rapporte à la situation native de la protéine dans la cellule intacte. Afin de parvenir à une courte distance entre l&#39;étiquette et le récepteur, l&#39;EGFR a été directement marqué par son ligand EGF, à l&#39;aide d&#39;une liaison biotine-streptavidine à une QD. Ce marqueur peut être détecté par microscopie par fluorescence à la fois et électrons. Nous avons utilisé cette étiquette pour l&#39;imagerie corrélative des cellules COS7 enliquide enfermé dans une chambre microfluidique précédemment 1,16,17. Cependant, en raison d&#39;un multiple de streptavidine molécules par QD, cette étiquette peut induire le regroupement des récepteurs, conduisant à une efficacité de marquage faible ou expériences plutôt coûteux, et il est impossible de conclure sur la stoechiométrie de la protéine sous enquête. Regroupement des récepteurs induite Label peut être évitée en utilisant la procédure d&#39;étiquetage en deux étapes présentée ici, résultant en une sonde comprenant EGF biotinylé à laquelle une seule streptavidine-points quantiques (STR-QD) est couplé. Les cellules sont d&#39;abord incubées avec EGF biotinylé, puis fixées. L&#39;étape de fixation détermine le point à partir duquel les processus de protéines sont arrêtés (en fonction de la vitesse de la fixation) de temps. STR-QD est appliquée par la suite en tant que deuxième étape du protocole de marquage. Clustering n&#39;a pas lieu puisque le mouvement de la membrane dynamique des protéines est encombrée lorsque les protéines sont fixés. En outre, la solution STR-QD, qui est leplus coûteux composant de l&#39;expérience, peut être appliquée dans une faible concentration optimisée, et cette deuxième étape de marquage est pas cruciale temps, à savoir la QD peut être couplé à plusieurs minutes. Pour étudier la stoechiométrie de l&#39;EGFR tel que distribué dans des cellules entières, des échantillons cellulaires ont été préparés sur des micropuces de silicium 18. Après l&#39;application de l&#39;étiquetage de QD en deux étapes, et l&#39;enregistrement d&#39;images de microscopie par fluorescence, les cellules ont été rincées avec de l&#39;eau pure, et imagés en état ​​hydraté en utilisant ESEM-STEM 19. Les images corrélatifs résultant fournissent des informations sur la distribution de l&#39;EGFR cellulaire, et la stoechiométrie dans leur contexte naturel des cellules hydratées. Une méthode similaire a été utilisée pour étudier les protéines HER2 dans les cellules du cancer du sein dans une étude récente 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>AF6000 + DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESEM</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td>Quanta 400 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstripper</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>25-056 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, chromasolv Plus for HPLC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Roti-Stock 10x PBS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1058.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Rotisolv HPLC grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>O163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7041-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T873.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shoul</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>E3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium teraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9640-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 800 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10173MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon microchips with silicon nitride membranes</td>
			<td>DENS Solutions</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>of 50 nm thickness and dimensions of 50 &#181;m x 0.40 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the stoichiometry of epidermal growth factor receptor in intact cells using correlative microscopy

Ce protocole décrit le marquage du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) sur des cellules de fibroblastes COS7, et après la microscopie par fluorescence et par microscopie corrélative électronique à balayage environnemental (ESEM) de cellules entières à l&#39;état hydraté. Les points quantiques (QD fluorescents) ont été couplés à l&#39;EGFR par un protocole de marquage en deux étapes, fournissant une protéine de marquage spécifique et efficace, tout en évitant le regroupement induite étiquette du récepteur. La microscopie à fluorescence a fourni des images aperçu des emplacements cellulaires de l&#39;EGFR. Le détecteur microscopie électronique en transmission à balayage (STEM) a été utilisé pour détecter les étiquettes QD avec une résolution nanométrique. Les images résultantes fournissent des données corrélatives de la distribution cellulaire de l&#39;EGFR, et la stoechiométrie à l&#39;échelle moléculaire unique dans le contexte naturel de la cellule intacte hydraté. Images ESEM-STEM a révélé le récepteur d&#39;être présent en tant que monomère, comme homodimère, et en petites grappes. Étiquetage avec deux points quantiques différents,soit un émettant à 655 nm et à 800 révélé des résultats caractéristiques similaires.

La figure 1 et 2 illustrent des images représentatives de QD655 marqué, EGFR lié à la membrane dans visualisées intactes, des cellules COS-7 entièrement hydratées cellules. L&#39;image DIC sur la figure 1 une donne une impression de la topographie de la membrane des cellules, et l&#39;image de fluorescence correspondant à la figure 1b montre la répartition de l&#39;EGFR après 3 min de EGF-biotine incubation. La figure 1A et B sont chacun cousues ensemble de deux les images enregistrées avec un objectif de l&#39;air 40X. L&#39;EGFR activé EGF est répartie sur toute la surface cellulaire. Dans la plupart des cellules une légère amélioration de la fluorescence (figure 1B) peut être vu sur les bords de la cellule, indiquant une présence accrue de l&#39;EGFR au niveau local 20. Des expériences témoins effectuées en utilisant un protocole similaire dignes de confiance marquage spécifique de l&#39;EGFR (données non présentées). Ces contrôles suivants: 1) un marquage témoin sans incubation préalable de la CELLS avec EGF-biotine, à savoir, que l&#39;incubation avec STR-QD, et 2) une incubation avec des non-biotinylé EGF et STR-QD. Les trois cellules marquées avec des rectangles ont été étudiés plus avec ESEM-STEM. Les images ESEM-SOUCHES représentées sur la figure 1C - E présentent de faibles aperçus d&#39;agrandissement de ces cellules. Ces images de transmission reflètent cellules entières dans un état hydraté avec mince couche d&#39;eau résidant sur la cellule placée sur une puce de silicium avec du nitrure de silicium (SiN) fenêtre de visualisation. La chambre à vide à la vapeur d&#39;eau contenue au microscope, et l&#39;équilibre entre la température et la pression échantillon a été ajusté à maintenir une mince couche de liquide sur les cellules. Les cellules individuelles peuvent être facilement reconnus en raison de leur forme et l&#39;emplacement de la fenêtre de la membrane SiN. Les images ESEM-SOUCHES faible grossissement révèlent des structures fines, comme filopodia, partant du bord de la cellule vers les cellules voisines, et certaines structuresà l&#39;intérieur des régions cellulaires plus fines. Régions cellulaires centrale épaisse dont le noyau apparaissent en blanc parce que la transmission à travers l&#39;échantillon est pas possible pour des électrons de l&#39;énergie utilisée (30 keV). Haute résolution images ESEM-STEM ont été enregistrées dans les régions périphériques, plus minces. La résolution spatiale pour ESEM-STEM de nanoparticules dans les régions minces de cellules dans une fine couche de liquide a été déterminée dans une étude précédente de 6 à élever à 3 nm. Quatre images haute résolution présentés dans la figure 2A - D ont été enregistrés à l&#39;emplacement des petits rectangles de la figure 1C - E. Le grossissement utilisé était suffisante pour discerner les points quantiques individuels, apparaissant, tiges en forme de balles que lumineuses, chacune liée à un individu EGFR. Le QD655 a des dimensions typiques de 6 x 14 nm 2. La figure 2A (correspondant à la zone rectangulaire indiqué sur la cellule dans Figure 1C) montre étiquettes QD sur une membrane replient diagonale traversant l&#39;image. Cette structure de membrane a une densité supérieure à celle de l&#39;EGFR les régions entourant la membrane. À plusieurs endroits, deux étiquettes étaient à proximité. Deux exemples avec des distances de 20 et 24 nm sont indiquées par des flèches. Ces paires d&#39;étiquettes sont interprétés comme appartenant à des dimères de l&#39;EGFR. La figure 2B montre un exemple par rapport au bord d&#39;une cellule (figure 1D, le rectangle à gauche), les monomères de l&#39;EGFR et de dimères peuvent être regardé aussi. La figure 2C (figure 1C, le rectangle à droite) a été enregistré d&#39;une région avec un signal de fluorescence plus faible, à savoir, la densité de l&#39;EGFR inférieur. Néanmoins, l&#39;EGFR a également été trouvé ici, dans dimères ainsi. En outre, deux groupes de 10 ou 11 EGFR étaient présents (voir ellipses). Figure 2D montre un autre exemple d&#39;un pli de la membrane (figure 1E) avec de petites grappes, y compris 5-6 EGFR, en plus de plusieurs monomèreset dimères. Comme un exemple du genre d&#39;information qui peut être obtenu à partir de ces données, la paire fonction de corrélation 21 g (x) a été déterminée pour tous les postes de l&#39;étiquette de la figure 2. Notez que cette analyse ne fait pas partie de ce protocole et la procédure a été décrite ailleurs 6,7. g (x) est une mesure de la probabilité d&#39;une particule se trouve à une certaine distance radiale à partir d&#39;une particule x de référence. g (x) = 1 représente une distribution aléatoire, et une valeur plus grande est la preuve pour le clustering. Les positions d&#39;un total de 210 étiquettes ont été automatiquement détectés dans les quatre images de la figure 2A-D, et g (x) a été calculée en utilisant une taille de bin de 5 nm et un filtre de lissage avec une largeur de bande de 10 nm. La courbe g (x) (figure 3) montre un centre à centre QD distance préférée de 25 nm. EGFR ne sont donc pas orientées de manière aléatoire, mais une fraction notable de leur réside à cette distance préférée. D&#39;un approximatmodèle moléculaire e 6 (figure 3 en médaillon), nous estimons que la distance de centre à centre entre le QD et la poche de liaison EGF revient à ~ la distance 14 nm, et de centre à centre entre les deux points quantiques attachés à un dimère de l&#39;EGFR à ~ 27 nm être (cette valeur est susceptible de varier par quelques nanomètres raison de la flexibilité du lieur). La distance d&#39;étiquette préféré est donc compatible avec la distance de l&#39;étiquette prévue pour le dimère de l&#39;EGFR à l&#39;intérieur de la précision de la méthode. Le g (x) est courbe supérieur à l&#39;unité pour la distance maximale de 300 nm, indiquant la présence de groupements, cohérent avec les données. Cette analyse montre que la stoechiométrie de l&#39;EGFR peut être étudié avec notre procédé. La figure 4 montre un résultat similaire à la Figure 2, sauf que le marquage a été réalisé avec EGF-QD800, et un objectif 63X à immersion d&#39;huile a été utilisée pour l&#39;image de fluorescence. Ces données confirment que ces résultats typiques sont également présents lorsquel&#39;étiquetage de l&#39;EGFR se fait avec les points quantiques, qui émettent dans le spectre proche rouge. La figure 4A est l&#39;image de fluorescence d&#39;une cellule représentative, la figure 4B montre la même cellule en mode aperçu ESEM-STEM et la figure 4C est une image de grossissement 150.000 x, enregistré à la frontière de la membrane supérieure de la cellule (voir le rectangle dans la figure 4B). Similaire à la figure 2A et D, les images saisissent EGFR QD marqué sur un pli de la membrane et montre récepteurs monomères, dimères, et en grappes. Notez que l&#39;électron noyau QD dense apparaît un peu plus petite et plus ronde que les noyaux des boîtes quantiques émettant à 655 nm, compatible avec leur petite taille du noyau de 22 ~ 5 nm. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig1.jpg" /> Figure 1. corrélative DIC, fluorescence et ESEM-STEM d&#39;EGF-QD655 étiqueté EGFR sur COS-7 entièrement hydratés cellules </stRong&gt;. image (A) DIC des cellules cultivées sur la zone de la fenêtre de la membrane péché, donnant une impression topographique de la membrane plasmique. (B) l&#39;image de fluorescence montrant des cellules sur la fenêtre de la membrane de SiN situé au centre (marqué par le rectangle en pointillés). (C - E) Trois ESEM-SOUCHES faible grossissement des images des cellules marquées avec des rectangles dans A et B. Ces images vue d&#39;ensemble de la cellule servent à déterminer l&#39;emplacement précis des images enregistrées ultérieurement à haute résolution. L&#39;emplacement de quatre images à haute résolution (Figure 2A-D) sont marqués par des rectangles blancs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig2.jpg" /> <strong&gt; Figure 2. haute résolution des images ESEM-SOUCHES représentant membranaires EGFR. (A) Microscopie à 75,000X agrandissement de la zone marquée dans la figure 1B. Beaucoup de monomères sont visibles. Plusieurs dimères sont indiqués par les flèches. (C) des images acquises à 50,000X grossissement de gauche (B) et, respectivement, les zones membranaires marqués à droite sur la figure 1C. Des grappes de EGFR sont décrites. L&#39;image (D) enregistré avec 50,000X grossissement à l&#39;emplacement marqué à la figure 1D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig3.jpg" /> Figure 3. Paire fonction de corrélation g (x) en tant que fonction de la distance radiale x déterminée pour l&#39;inter-parti<html> distances CLE de toutes les 210 étiquettes détectés à la figure 2A-D. Le pic à 25 nm indique qu&#39;un QD distance de centre-à-centre a beaucoup plus de chances de se produire que aléatoire, lequel ag (x) = 1 indique un hasard. La ligne en pointillé est un guide à l&#39;œil représentant g (x) d&#39;une distribution aléatoire. L&#39;encart montre un modèle moléculaire approximatif du dimère de l&#39;EGFR avec EGF lié et revêtues de streptavidine QDs fixés par l&#39;intermédiaire de la biotine. Les modèles de la streptavidine, l&#39;EGF et le EGFR ont été obtenus à partir de modèles de CPK du 1stp (streptavidine), 1EGF (EGF), 1NQL, 2JWA, 1M17, structures du RCSB Protein Protein Databank, créé par Jmol Version 1IVO et 2GS6 (EGFR) 12.2.15. Le modèle de la biotine est aussi dessiné dans RCSB Ligand Explorer version 1.0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> /53186/53186fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4. exemplaire COS-7 cellules marquées avec de l&#39;EGF-QD800 et imagé avec fluorescence corrélative et ESEM-STEM. (A) image de fluorescence, (B) faible aperçu de grossissement d&#39;image ESEM-STEM. (C) de l&#39;image à haute résolution enregistrée à l&#39;emplacement du rectangle en b au 150,000X grossissement. EGFR monomères, dimères, et en grappes sont détectés similaire à l&#39;étiquetage avec EGF-QD655. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

L&#39;étude de la Stœchiométrie Epidermal Growth Factor Receptor dans des cellules intactes en utilisant la microscopie corrélative

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

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