Name: employing digital droplet pcr to detect braf v600e mutations in formalin-fixed paraffin-embedded reference standard cell lines
Uploaded: 2015-10-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines at JoVE.com

इस शोध विज्ञान, सूचना और संचार प्रौद्योगिकी और भविष्य योजना (अनुदान सं 2013M3C8A1075908) मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन के समाज के लिए अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (एनआरएफ) द्वारा समर्थित किया गया।

FFPE निर्देश मानक सेल लाइनों से 1. डीएनए निष्कर्षण नोट: इस प्रक्रिया के लिए, डीएनए निष्कर्षण नीचे प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप FFPE ऊतक डीएनए अलगाव किट का उपयोग कर FFPE संदर्भ मानक सेल लाइनों (HD598, HD593, HD617, HD273...

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	<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development.">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li><li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition.">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li><li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras/Raf/+MEK/ERK+pathway.">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li><li>Brose, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+and+RAS+mutations+in+human+lung+cancer+and+melanoma.">BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma.</a> Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+in+colon+cancer+are+not+likely+attributable+to+defective+DNA+mismatch+repair.">BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair.</a> Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number.">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification.">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li><li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline,+'definetherain'.">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li><li>Strain, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+precise+measurement+of+HIV+DNA+by+droplet+digital+PCR.">Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR.</a> PloS one. 8, e55943 (2013).</li><li>Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR.">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li><li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+using+digital+PCR.">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li><li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR.">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li><li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations.">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li><li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li><li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues.">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li><li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR.">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li></ol>

यहाँ, हम एक विशेष जीन उत्परिवर्तन मूल्यांकन के लिए FFPE संदर्भ मानक सेल लाइन के नमूनों से ddPCR की प्रयोज्यता और डीएनए अलगाव पर प्रकाश डाला। इस अध्ययन में, टीपीएस स्वचालित डीएनए अलगाव विधि आसानी से, स्वचालित...

कुंजी नियामक जीन में आनुवंशिक परिवर्तन के संचय कैंसर 1 के लिए अग्रणी, सेल प्रसार, भेदभाव, और अस्तित्व की तरह सामान्य कोशिका प्रोग्रामिंग बदल। आरएएस-आरएएफ-एमएपी काइनेज मार्ग विकास संकेतों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता करता है। ऑन्कोजेनिक BRAF म्यूटेशन 2 अति बनने के लिए oncoprotein BRAF कारण हो सकता है जो BRAF जीन में म्यूटेशन ड्राइवर, से परिणाम कर सकते हैं। BRAF जीन में उत्परिवर्तन भी बारी में, वृद्धि कारक की मध्यस्थता विनियमन 4-6 की स्वतंत्र रूप से अत्यधिक सेल के विकास और प्रसार के लिए होता है, जो खल्क और ERK 3, के माध्यम से अति बहाव के संकेत में परिणाम। कई उपकरण ऐसे ddPCR द्वारा formalin तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) संदर्भ मानक सेल लाइनों में मात्रात्मक वास्तविक समय BRAF V600E म्यूटेशन के रूप में, डीएनए उत्परिवर्तन की रूपरेखा के लिए उपलब्ध हैं। ddPCR पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए एक पीसीआर आधारित विधि हैपारंपरिक मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) 7.8 की तुलना में अधिक सटीकता की पेशकश की। ddPCR भी अधिक सूचनात्मक कैंसर अनुसंधान और निदान 9 सक्षम करने, डीएनए टेम्पलेट्स में दुर्लभ म्यूटेशन का पता लगाने के लिए शक्ति और सटीकता को हल करने में अधिक प्रदान करता है। कम टेम्पलेट प्रतिलिपि संख्या 10-12 का अध्ययन करते समय पारंपरिक qPCR खत्म ddPCR का अतिरिक्त लाभ अपने बढ़ाया संवेदनशीलता और सटीकता शामिल हैं। इस के साथ साथ, स्वचालित रूप से ddPCR द्वारा BRAF V600E म्यूटेशन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण करने के द्वारा पीछा FFPE संदर्भ मानक सेल लाइनों, से डीएनए निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया है। डेटा विश्लेषण और परिणामों की एक चित्रमय प्रतिनिधित्व के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग भी वर्णित हैं। पूरी प्रक्रिया अपेक्षाकृत आसान है और पूरी तरह से प्रोफाइल किए गए नमूनों की संख्या और उपलब्ध पारंपरिक पीसीआर और ddPCR मशीनों की संख्या पर निर्भर करता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल BR के लिए मानक प्रक्रियाओं का वर्णन<html> वायुसेना V600E पॉजिटिव FFPE संदर्भ मानक सेल लाइनों (HD598, HD593, HD617, HD273 और wildtype (डब्ल्यूटी)) ऊतक तैयार करने की प्रणाली (टीपीएस) प्रोटोकॉल का उपयोग एक पूरी तरह से स्वचालित उपकरण में किया जाता है। बाद में, पृथक डीएनए नमूने ddPCR प्रणाली का उपयोग कर BRAF V600E म्यूटेशन की उपस्थिति के लिए विश्लेषण कर रहे हैं। सभी नमूनों profiled गया है के बाद लक्षित उत्परिवर्तन विश्लेषण किया जाता है और डेटा डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में लोड कर दिया गया है। नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है / समूहों का अध्ययन किया, डेटा विश्लेषण एक से कई घंटे के लिए आवश्यकता हो सकती है। कार्यप्रणाली की प्रयोगात्मक घटक निपटने में सटीकता की आवश्यकता <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="खमीर से न्यूक्लिक एसिड अलग-थलग, एक जौव विज्ञान शिक्षा वीडियो शाही सेना के संदर्भ के बारे में के बारे में अधिक समझा">डीएनए</a> औरrological pipettes और Pipettors, pipetting के संदर्भ के बारे में के बारे में अधिक समझा एक जौव विज्ञान शिक्षा वीडियो &quot;&gt; 96 प्लेटों में pipetting, डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10701001</td>
			<td>Automated DNA isolation instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>772BR1119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>771BR1497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment</td>
			<td></td>
			<td>621BR17718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>770BR1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA isolation kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-RE tips</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR mutation analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3010</td>
			<td>2X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

employing digital droplet pcr to detect braf v600e mutations in formalin-fixed paraffin-embedded reference standard cell lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

हमारे ddPCR विश्लेषण के लिए, हम BRAF V600E उत्परिवर्तन FFPE संदर्भ मानक सेल लाइनों का अध्ययन किया। छोटी बूंद पाठक एक लैपटॉप कंप्यूटर चलाने के डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर को जोड़ता है। प्रत्येक व्यक्ति छोटी बूंद भ...

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Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

इस वीडियो के लक्ष्य के लिए एक नैदानिक ​​सेटिंग में दुर्लभ म्यूटेशन का पता लगाने के लिए formalin तय आयल एम्बेडेड (FFPE) संदर्भ मानक सेल लाइनों और डिजिटल छोटी बूंद पीसीआर (ddPCR) विश्लेषण से स्वचालित डीएनए निष्कर्षण प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए है। FFPE नमूनों में म्यूटेशन का पता लगाने के FFPE नमूनों में ddPCR के नैदानिक ​​उपयोगिता को दर्शाता है।

डिजिटल बूंद पीसीआर Formalin तय आयल एम्बेडेड निर्देश मानक सेल लाइनों में BRAF V600E उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए रोजगार

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Research

JoVE Journal

Biology

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In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

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In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

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qPCR formalin-तय, आयल एम्बेडेड बायोप्सी ऊतक में Cytomegaloviral डीएनए का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील और तेजी से विधि है

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

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Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

चुंबकीय-सक्रिय सेल छंटाई रणनीतियों को अलग करने और शुद्ध श्लेष द्रव-व्युत्पंन Mesenchymal एक खरगोश मॉडल से स्टेम कोशिकाओं

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

एक मानक के रूप में सेल लाइनों की मात्रात्मक Immunoblotting नियमित ऊतक नमूनों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए अचिह्नित प्रोटीन को प्रमाणित करने के लिए

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...