Name: employing digital droplet pcr to detect braf v600e mutations in formalin-fixed paraffin-embedded reference standard cell lines
Uploaded: 2015-10-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di ricerca e sviluppo per la società della Fondazione Nazionale delle Ricerche (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT &amp; Future Pianificazione (Grant No. 2013M3C8A1075908).

1. Estrazione del DNA da linee cellulari FFPE di riferimento standard Nota: Per questa procedura, estrazione del DNA è stata effettuata da linee cellulari standard di riferimento FFPE (HD598, HD593, HD617, HD273 e di tipo selvatico (WT)) utilizzando il tessuto DNA Kit di isolamento FFPE come descritto nel protocollo di seguito. Estrazione del DNA automatizzato è stato ottenuto seguendo le istruzioni del produttore per l&#39;estrazione del DNA totale. <ol><li> Utilizzando un microtomo e i...

<ol>
	<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development.">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li><li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition.">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li><li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras/Raf/+MEK/ERK+pathway.">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li><li>Brose, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+and+RAS+mutations+in+human+lung+cancer+and+melanoma.">BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma.</a> Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+in+colon+cancer+are+not+likely+attributable+to+defective+DNA+mismatch+repair.">BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair.</a> Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number.">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification.">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li><li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline,+'definetherain'.">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li><li>Strain, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+precise+measurement+of+HIV+DNA+by+droplet+digital+PCR.">Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR.</a> PloS one. 8, e55943 (2013).</li><li>Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR.">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li><li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+using+digital+PCR.">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li><li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR.">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li><li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations.">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li><li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li><li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues.">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li><li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR.">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li></ol>

Qui, si evidenzia l&#39;applicabilità di ddPCR e isolamento del DNA da campioni di linee cellulari normali di riferimento FFPE una specifica valutazione mutazione del gene. In questo studio, TPS DNA metodo di isolamento automatico viene utilizzato, che può essere facilmente adattato, automatizzato, e può ospitare fino a 48 campioni diversi contemporaneamente, consentendo per esperimenti su scala più ampia e bassa variabilità. Uno dei limiti di isolamento del DNA nel presente lavoro è che ogni campione FFPE è unic...

L&#39;accumulo di mutazioni genetiche nei principali geni regolatori altera programmazione cellula normale come la proliferazione cellulare, il differenziamento e la sopravvivenza, che porta al cancro 1. La chinasi RAS-RAF-MAP media le risposte cellulari ai segnali di crescita. Mutazioni BRAF oncogeno possono derivare da mutazioni del driver nel gene BRAF, che possono causare il BRAF oncoprotein a diventare iperattiva 2. Le mutazioni nel gene BRAF anche tradursi nella segnalazione a valle iperattiva tramite MEK e ERK 3, che, a sua volta, porta alla crescita eccessiva delle cellule e la proliferazione indipendentemente da fattore di crescita-mediata regolazione 4-6. Sono disponibili diversi strumenti per la mutazione del DNA profiling, come ad esempio in tempo reale mutazioni BRAF V600E quantitativi fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) di riferimento standard di linee cellulari di ddPCR. ddPCR è un metodo basato sulla PCR per la quantificazione assolutaoffrendo una maggiore precisione rispetto ai tradizionali quantitativa real-time PCR (qPCR) 7,8. ddPCR fornisce anche una maggiore potenza e precisione la risoluzione per la rilevazione di mutazioni rare nei modelli di DNA, consentendo la ricerca sul cancro più informativo e la diagnosi 9. Ulteriori vantaggi di ddPCR oltre qPCR convenzionale sono la sua maggiore sensibilità e precisione quando si studia il numero di copie a basso modello 10-12. Qui, un protocollo per estrarre automaticamente DNA da linee cellulari normali riferimento FFPE, seguiti da determinare la presenza o l&#39;assenza di mutazioni BRAFV600E da ddPCR è dimostrata. L&#39;utilizzo di software per l&#39;analisi dei dati e una rappresentazione grafica dei risultati sono anche descritti. L&#39;intera procedura è relativamente semplice e totalmente dipende dal numero di campioni da profilati e il numero delle macchine convenzionali PCR e ddPCR disponibili. Il protocollo che segue descrive le procedure standard per la BR<html> AF-V600E positivi di riferimento FFPE linee di cellule normali (HD598, HD593, HD617, HD273 e di tipo selvatico (WT)) viene eseguita in uno strumento completamente automatico che utilizza il protocollo Tissue preparazione sistema (TPS). Successivamente, i campioni di DNA isolati vengono analizzati per la presenza di mutazioni BRAF V600E utilizzando il sistema ddPCR. Analisi mirata mutazione viene eseguita dopo tutti i campioni sono stati profilato e i dati sono stati caricati nel software di analisi dati. A seconda del numero di campioni / gruppi studiati, analisi dei dati può richiedere da una a diverse ore. Il componente sperimentale della metodologia richiede accuratezza nella gestione <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="L&#39;isolamento degli acidi nucleici da lievito, un video JOVE Scienze della Formazione spiegare di più sul contesto di RNA">DNA</a> erological Pipette e pipette, un video JOVE Scienze della Formazione spiegare di più sul contesto di pipettaggio &quot;&gt; pipettaggio in 96 pozzetti, mentre l&#39;analisi dei dati viene eseguita utilizzando il software.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10701001</td>
			<td>Automated DNA isolation instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>772BR1119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>771BR1497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment</td>
			<td></td>
			<td>621BR17718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>770BR1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA isolation kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-RE tips</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR mutation analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3010</td>
			<td>2X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

employing digital droplet pcr to detect braf v600e mutations in formalin-fixed paraffin-embedded reference standard cell lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

Per la nostra analisi ddPCR, abbiamo studiato le linee di cellule normali di riferimento mutazione FFPE BRAFV600E. Il lettore droplet si connette a un software portatile di analisi dei dati del computer in esecuzione. Ogni singola goccia viene definita sulla base dell&#39;ampiezza fluorescente come positivo o negativo. Il software fornito dal produttore permette anche un taglio definito dall&#39;utente da immettere per definire la soglia tra le goccioline positivi e negativi. Il numero di goccioline positivi e ...

Watch this Scientific Journal Video about Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines at JoVE.com

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

L&#39;obiettivo di questo video è quello di dimostrare come eseguire l&#39;estrazione del DNA automatizzato da inclusi in paraffina linee cellulari fissate in formalina (FFPE) di riferimento standard e delle gocce digitali PCR (ddPCR) analisi per individuare mutazioni rare in un ambiente clinico. Rilevamento mutazioni nei campioni FFPE dimostra l&#39;utilità clinica di ddPCR in campioni FFPE.

Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Research

JoVE Journal

Biology

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