Name: differentiation of the sh-sy5y human neuroblastoma cell line
Uploaded: 2016-02-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line at JoVE.com

We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).

1. اعتبارات عامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انظر جدول المواد / المعدات للحصول على قائمة من الكواشف اللازمة. تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة صارمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (hiFBS) لجميع الاستعدادا...

وينص البروتوكول أعلاه طريقة واضحة وقابلة للتكرار لتوليد الخلايا العصبية الثقافات البشرية متجانسة وقابلة للحياة. هذا البروتوكول يستخدم التقنيات والممارسات التي تدمج العديد من الطرق التي نشرت سابقا 1-4 والأهداف لتحديد أفضل الممارسات من كل. تمايز الخلايا SH-SY5Y يع...

القدرة على استخدام نظم نموذج المختبر عزز كثيرا من مجالات علم الأعصاب وعلم الأعصاب. الخلايا في الثقافة بمثابة منصة فعالة لتوصيف وظيفة البروتين والآليات الجزيئية الظواهر المحددة الأساسية، لفهم علم الأمراض من الأمراض والعدوى، وإجراء عمليات تقييم اختبار المخدرات الأولية. في علم الأعصاب، وأنواع رئيسية من نماذج ثقافة الخلية تشمل الثقافات العصبية الأولية المستمدة من الجرذان والفئران، وخطوط الخلايا العصبية مثل خلايا الفئران B35 5، العصبية-2A خلايا فأر 6، وخلايا الفئران PC12 7. على الرغم من أن استخدام خطوط الخلايا مثل هذه تقدمت مجال كبير، وهناك عدة عوامل خارجية مرتبطة التعامل مع الخلايا غير والأنسجة البشرية. وتشمل هذه الأنواع المحددة فهم الاختلافات في عمليات التمثيل الغذائي، الظواهر من مظاهر المرض، والتسبب بالمقارنة مع البشر. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أنإعادة اختلافات كبيرة بين الماوس والتعبير الجيني البشري وعامل النسخ الإشارات، وتسليط الضوء على القيود المفروضة على نماذج القوارض وأهمية التفاهم التي تم حفظها الممرات بين القوارض والبشر 8-11. ويعمل آخرون على استخدام خطوط الخلايا العصبية البشرية بما في ذلك N-تيرا-2 (NT2) خط البشري خلية سرطانة مسخية والخلايا الجذعية المحفزة محرض (iPSCs). هذه خطوط الخلايا توفر نماذج جيدة لفي المختبر النظم البشرية. ومع ذلك، تمايز الخلايا NT2 مع حمض الريتينويك (RA) النتائج في توليد يسكنها خليط من الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية شعاعي 12، مما استلزم خطوة تنقية إضافية للحصول على مجموعات نقية من الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا NT2 يبرهن على وجود النمط النووي متغير بدرجة كبيرة 13، مع أكثر من 60 الكروموسومات في 72٪ من الخلايا. iPSCs تظهر التباين في التفريق بين خطوط مختلفة من الخلايا وتتفاوت في كفاءة التمايز<html> 14، وبالتالي من المستحسن أن يكون نموذجا الخلايا العصبية البشرية متسقة وقابلة للتكرار لتكمل هذه البدائل. SH-SY5Y خلايا تشبه أرومة عصبية هي subclone من الوالدين خط الخلية العصبية SK-N-SH. تم إنشاء خط الخلية الوالدية في عام 1970 من خزعة نخاع العظم الذي يحتوي على خلايا تشبه الخلايا الظهارية 15 على حد سواء مثل أرومة عصبية و. الخلايا SH-SY5Y لديها النمط النووي مستقرة تتكون من 47 كروموسوم، ويمكن أن تكون متباينة من دولة مثل أرومة عصبية إلى الخلايا العصبية البشرية الناضجة من خلال مجموعة متنوعة من الآليات المختلفة بما في ذلك استخدام RA، استرات phorbol، وneurotrophins محددة مثل المستمدة الدماغ عامل التغذية العصبية (BDNF). وتشير الأدلة السابقة أن استخدام أساليب مختلفة يمكن اختيار لفرعية الخلايا العصبية محددة مثل الأدرينالية، الكوليني، والخلايا العصبية الدوبامين 16،17. هذا الجانب الأخير يجعل الخلايا SH-SY5Y مفيدة للعديد من التجارب علم الأعصاب. ontent &quot;&gt; وقد لاحظ العديد من الدراسات اختلافات هامة بين الخلايا SH-SY5Y في ولاياتهم غير متمايزة ومتباينة، وعندما الخلايا SH-SY5Y هي غير متمايزة، فإنها تتكاثر بسرعة، ويبدو أن غير مستقطب، مع عدد قليل جدا من العمليات، قصيرة. وغالبا ما تنمو في كتل والتعبير عن علامات تدل على الخلايا العصبية غير ناضجة 18،19. وعندما متباينة، وهذه الخلايا تمتد طويلا، تشعبت العمليات، وانخفاض في انتشار، وفي بعض الحالات استقطاب 2،18. تم الخلايا SH-SY5Y متباينة تماما أثبتت سابقا للتعبير عن مجموعة متنوعة من علامات مختلفة من الخلايا العصبية الناضجة بما في ذلك البروتين المرتبط النمو (GAP-43)، نوى الخلايا العصبية (NeuN)، synaptophysin (SYN)، متشابك بروتين حويصلة الثاني (SV2)، الخلايا العصبية إينولاز معين (NSE) وأنيبيب المرتبطة بروتين (MAP) 2،16،17،20، وتفتقر إلى التعبير عن علامات الدبقية مثل ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) (4). وفي مزيد من الدعم الذي يميز الخلايا SH-SY5Y represeالإقليم الشمالي يبلغ عدد سكانها العصبية متجانسة، وإزالة عامل التغذية العصبية نتائج في الخلايا الخلوية (4). هذا يشير إلى أن بقاء الخلايا SH-SY5Y متباينة تعتمد على العوامل الغذائية، مماثلة إلى أن تنضج الخلايا العصبية. وقد ازداد استخدام الخلايا SH-SY5Y منذ تأسيس subclone في عام 1978 3. وتشمل بعض الأمثلة على استخدامها يحقق مرض باركنسون 17 ومرض الزهايمر 21، والتسبب في العدوى الفيروسية بما في ذلك فيروس شلل الأطفال 22، الفيروس المعوي 71 (EV71) 23،24 وفيروس الحماق النطاقي (جدري الماء) 1، والفيروس المضخم للخلايا الإنسان 25، وفيروس الهربس البسيط (HSV) 2،26. من المهم أن نلاحظ أن العديد من الدراسات باستخدام الخلايا SH-SY5Y وقد استخدمت هذه الخلايا في شكلها غير متمايز، وخاصة في مجال neurovirology 27-36. الاختلاف في النمط الظاهري الملحوظ من غير متمايزة مقابل الخلايا SH-SY5Y متباينة يثير مسألة عرجذر التقدم لوحظ من العدوى ستكون مختلفة في الخلايا العصبية متباينة ناضجة. على سبيل المثال، متباينة الخلايا SH-SY5Y لها كفاءة أعلى من HSV-1 امتصاص مقابل غير متمايزة، تكاثر الخلايا SH-SY5Y، والذي قد يكون نتيجة لعدم وجود مستقبلات سطح التي تربط HSV وتعدل الدخول على غير متمايزة خلايا SH-SY5Y 2. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن عند تصميم تجربة تركز على اختبار الخلايا العصبية في المختبر، ينبغي التمييز بين الخلايا SH-SY5Y من أجل الحصول على أدق النتائج للترجمة وبالمقارنة مع النماذج في الجسم الحي. تطوير طريقة يمكن الاعتماد عليها لتوليد الثقافات العصبية الإنسان أمر حتمي السماح للباحثين لإجراء تجارب متعدية هذا النموذج بدقة الجهاز العصبي البشري. بروتوكول المقدمة هنا هو الإجراء الذي يحدد أفضل الممارسات المستمدة من الطرق السابقة 1-4 لإثراء لالخلايا العصبية البشرية التي متباينةاستخدام حمض الريتينويك.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">B-27</td>
			<td style="width:141px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:133px;">17504-044</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:141px;">Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">D0627</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">DMSO</td>
			<td style="width:141px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">4-X</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:141px;">Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">M5650</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Fetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">GlutamaxI</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">35050-061</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Glutamine</td>
			<td style="width:141px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30034.01</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:141px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">BP366-1</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:141px;">MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">E0282</td>
			<td style="width:232px;">See step 11 of the protocol</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">21103-049</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:141px;">Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">15140-122</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Retinoic acid (RA)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">R2625</td>
			<td style="width:232px;">Should be stored in the dark at 4&#176; C because this reagent is light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">SH-SY5Y Cells</td>
			<td style="width:141px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">CRL-2266</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">0.5% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">15400-054</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:141px;">Falcon 35mm TC dishes</td>
			<td style="width:141px;">Falcon (A Corning Brand)</td>
			<td style="width:133px;">353001</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of the sh-sy5y human neuroblastoma cell line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

في الوقت الحاضر، هناك العديد من الحالات في مجال علم الأعصاب وneurovirology حيث يتم استخدام الخلايا SH-SY5Y غير متمايزة كنموذج عملي لالخلايا العصبية البشرية 27-36، والأهم من ذلك، خلايا غير متمايزة قد تفتقر الظواهر مثل الأمثل امتصاص الفيروسي 2 التي هي ضرورة التفسير ال...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line at JoVE.com

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

التفريق بين الخط خلية SH-SY5Y العصبية الإنسان

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

التمايز من العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية على الثقافات الثلاث الأبعاد، تحليل الجينات الرنا الميكروي، واعتبارا الهدف

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

التفريق بين الرجفان العضلية من الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام BMP خصم Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

عزل ميوبلاستس الإنسان، تقييم التمايز العضلي، وقياس دخول الكالسيوم التي تديرها المخازن

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

الارتداد الكيميائية للخلايا الجذعية Pluripotent البشرية التقليدية إلى حالة شبيهة بالسذاجة مع التمايز مولتيلينيجي تحسين فاعلية

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

البطانة الظهارة الظهارية الظهارة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حالة محددة خالية من التغذية وXeno

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

العلاج العابر للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى مع DMSO لتعزيز التمايز

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...