Name: three-dimensional quantification of dendritic spines from pyramidal neurons derived from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2015-10-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.

1. Cultura Neuronal Nota: reprogramação de fibroblastos em células-tronco pluripotentes, o compromisso com a linhagem telencéfalo dorsal, derivação, amplificação e bancário de progenitores corticais final (LCP) foram descritas em Boissart et al 4. A diferenciação neuronal de células-LCP como também foi realizada de acordo com Boissart et ai 4 com ligeiras modificações. Outros procedimentos foram desenvolvidos para a reprogramação directa...

<ol>
	<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism.">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li><li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex.">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li><li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions.">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li><li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening.">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).</li><li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+beta+2*+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion.">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+synaptic+adhesion+with+dendritic+spine+remodeling+by+AF6+and+kalirin-7.">Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7.</a> Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).</li><li>Srivastava, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afadin+is+required+for+maintenance+of+dendritic+structure+and+excitatory+tone.">Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).</li><li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dendritic+spine+morphology+in+cultured+CNS+neurons.">Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).</li><li>Brennand, K. J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychiatric+disorders+through+reprogramming.">Modeling psychiatric disorders through reprogramming.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).</li><li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li><li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells:+a+game+changer+for+future+medicine.">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li><li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells.">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li><li>Sivapatham, R., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell+for+disease+modeling.">Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome.">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).</li></ol>

A quantificação das características morfológicas dos neurônios piramidais contou com o software. A interface Filament Tracer foi utilizada para a segmentação de neurônios e espinhos, eo módulo XT foi utilizado para suas análises. Para analisar a precisão da nossa técnica, primeiro comparou os parâmetros morfológicos medidos (comprimento, área e volume total de espinha quando aplicável), com os publicados usando ratos neurônios piramidais maduros na cultura 6, 7 e ...

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais corticais são pequenas e finas saliências que são distribuídos ao longo das dendrites basais e apicais de esses subtipos neuronais em roedores, primatas e cérebro humano. Eles são os sites da maioria das sinapses excitatórias e exibir funções-chave na aprendizagem e processos cognitivos. As estruturas detalhadas de espinhas dendríticas humanas foram tecnicamente estudada por microscopia eletrônica de 2. No entanto, tal abordagem é demorado e representa a carga de trabalho pesado. Mais recentemente, um (3D) reconstrução tridimensional da morfologia das espinhas dendriticas foi reportado no córtex do cérebro humano utilizando um software específico combinados para análise grande coluna Manual 3. A tecnologia verde proteína fluorescente (GFP) acoplado a imunofluorescência representa uma ferramenta precisa para a identificação e medição espinha forma por microscopia de fluorescência. Esta abordagem pode ser facilmente aplicado a culturas de neurónios. However, há dados foram relatados na análise de maturação coluna e morfologia em neurônios humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC). O objetivo deste estudo foi descrever um protocolo, que permite imagens espinha dendrítica de neurônios humanos cultivados in vitro. Rotulagem GFP, microscopia confocal e análise 3D com o módulo de software de Filamento Tracer Imaris foram utilizados no presente protocolo. Culturas etapas que são necessárias para obter neurónios glutamatérgicos do córtex das camadas II a IV a partir de células estaminais neurais (NSC) também são brevemente descritos aqui. Todo o protocolo para a produção NSC humano já foi publicado em outros lugares 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement w/o vit A (50X)</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Med SFM</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Steptomycin</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A-6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit&#160;</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibroblasts</td>
			<td>Coriell Cell Line Biorepository</td>
			<td>GM 4603 and GM 1869</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss (Germany)</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich</td>
			<td>6.4.0 version</td>
			<td>Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Software</td>
			<td>Huygens software, SVI, Netherlands</td>
			<td>Pro version</td>
			<td>Optional (for deconvolution testing)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional quantification of dendritic spines from pyramidal neurons derived from human induced pluripotent stem cells

As espinhas dendríticas são pequenas saliências que correspondem aos compartimentos pós-sinápticas das sinapses excitatórias no sistema nervoso central. Eles estão distribuídos ao longo dos dendritos. A sua morfologia é em grande parte dependente da actividade neuronal, e eles são dinâmicos. Espinhas dendríticas expressam receptores glutamatérgicos (receptores AMPA e NMDA) em sua superfície e nos níveis de densidade pós-sináptica. Cada coluna permite que o neurônio para controlar sua atividade estatal e local de forma independente. Spine morfologias têm sido extensivamente estudadas em células piramidais glutamatérgicos do córtex cerebral, usando ambas as abordagens in vivo e culturas neuronais obtidos a partir de tecidos de roedores. Condições neuropatológicas podem ser associados à indução da coluna alterada e maturação, como mostrado em roedores neurónios em cultura e análise quantitativa unidimensional 1. O presente estudo descreve um protocolo para a análise quantitativa 3D de morfologias coluna usando cortic humanoneurônios al derivadas de células estaminais neurais (progenitoras corticais final). Estas células foram inicialmente obtida a partir de células estaminais pluripotentes induzidas. Este protocolo permite a análise da morfologia da coluna vertebral em diferentes períodos de cultura, e com a possibilidade de comparação entre as células-tronco pluripotentes induzidas obtidas de indivíduos controle com aqueles obtidos de pacientes com doenças psiquiátricas.

<html> O presente estudo descreve um protocolo padronizado para a coluna quantificação das dendrites cultura de neurônios piramidais derivadas da IPSC. Este protocolo permite a análise de maturação coluna sobre neurónios humanos e sua possível comparação com a maturação das espinhas em culturas neuronais de roedores normais, bem como em modelos animais in vivo. A Figura 1A representa um esquema dos diferentes passos de cultura que permitem a produção de...

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Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Geração de Integração Induced-livre Human células estaminais pluripotentes usando o cabelo derivado queratinócitos

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Biologia do Desenvolvimento

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Derivação sem alimentador de melanócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de melanoma humano linfócitos tumor infiltrantes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Condrócitos diferenciadores de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivadas de sangue periférico

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Formação de grânulos condrogénicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por sangue do cordão umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

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Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

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