Name: three-dimensional quantification of dendritic spines from pyramidal neurons derived from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2015-10-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.

1. Neuronala Kultur Obs: Fibroblast omprogrammering i pluripotenta stamceller, engagemang för rygg telencephalon härstamning, härledning, förstärkning samt bank av sena kortikala stamceller (LCP) beskrevs i Boissart et al 4. Neuronal differentiering av LCP-liknande celler utfördes även enligt Boissart m fl 4 med smärre ändringar. Andra förfaranden har utvecklats för direkt omprogrammering av fibroblaster i inducerade pluripotenta stamceller f?...

<ol>
	<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism.">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li><li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex.">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li><li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions.">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li><li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening.">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).</li><li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+beta+2*+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion.">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+synaptic+adhesion+with+dendritic+spine+remodeling+by+AF6+and+kalirin-7.">Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7.</a> Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).</li><li>Srivastava, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afadin+is+required+for+maintenance+of+dendritic+structure+and+excitatory+tone.">Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).</li><li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dendritic+spine+morphology+in+cultured+CNS+neurons.">Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).</li><li>Brennand, K. J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychiatric+disorders+through+reprogramming.">Modeling psychiatric disorders through reprogramming.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).</li><li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li><li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells:+a+game+changer+for+future+medicine.">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li><li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells.">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li><li>Sivapatham, R., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell+for+disease+modeling.">Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome.">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).</li></ol>

Den kvantifiering av de morfologiska egenskaperna hos pyramidala nervceller förlitat sig på programvaran. Glöd Tracer gränssnitt användes för segmentering av nervceller och ryggar, och XT-modul användes för sin analys. För att analysera riktigheten i vår teknik, vi först jämfört de uppmätta morfologiska parametrar (längd, area och total rygg volym i förekommande fall), med de som publicerats med hjälp av råtta mogna pyramidala nervceller i odling 6, 7 och mänskl...

Dendritutskotten av kortikala pyramidala nervceller är små och tunna utsprång som är fördelade längs basala och apikala dendriter av dessa neuronala subtyper hos gnagare, primater och mänskliga hjärnan. De är platserna för de flesta excitatoriska synapser och visa viktiga funktioner i lärande och kognitiva processer. De detaljerade strukturer mänskliga Dendritutskotten har tekniskt studerats genom elektronmikroskopi 2. Men är sådant tillvägagångssätt tidskrävande och representerar hög arbetsbelastning. På senare tid har en tredimensionell (3D) rekonstruktion av morfologi Dendritutskotten rapporterats i mänskliga hjärnan cortex använder särskild programvara kombineras till stora manuell rygg analys 3. Fluorescerande protein (GFP) teknologi Grön kopplad till immunofluorescens utgör en korrekt verktyg för ryggraden identifiering och form mätning genom fluorescensmikroskopi. Detta tillvägagångssätt kan lätt appliceras på odlade neuroner. However, har inga uppgifter rapporterats på en analys av ryggraden mognad och morfologi om mänskliga nervceller härrör från inducerade pluripotenta stamceller (IPSC). Syftet med denna studie var att beskriva ett protokoll, vilket gör att dendritiska ryggraden avbildning från odlade humana neuroner in vitro. GFP märkning, konfokalmikroskopi och 3D-analys med glödlamporna Tracer-modulen i Imaris programvara användes i detta protokoll. Kultur steg som är nödvändiga för att erhålla kortikala glutamaterga neuroner i skikt II-IV från neurala stamceller (NSC) är också beskrivs kortfattat här. Hela protokollet för human NSC produktion har redan publicerats på annat håll 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement w/o vit A (50X)</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Med SFM</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Steptomycin</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A-6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit&#160;</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibroblasts</td>
			<td>Coriell Cell Line Biorepository</td>
			<td>GM 4603 and GM 1869</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss (Germany)</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich</td>
			<td>6.4.0 version</td>
			<td>Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Software</td>
			<td>Huygens software, SVI, Netherlands</td>
			<td>Pro version</td>
			<td>Optional (for deconvolution testing)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional quantification of dendritic spines from pyramidal neurons derived from human induced pluripotent stem cells

Dendritutskotten är små utsprång som motsvarar de postsynaptiska fack excitatoriska synapser i det centrala nervsystemet. De är fördelade längs dendriter. Deras morfologi är till stor del beroende av neuronal aktivitet, och de är dynamiska. Dendritutskotten uttrycker glutamaterga receptorer (AMPA och NMDA-receptorer) på sin yta och med den grad av postsynaptiska tätheter. Varje ryggraden gör neuron att kontrollera dess tillstånd och lokal verksamhet självständigt. Spine morfologier har i stor omfattning studerats i glutamaterga pyramidala celler i hjärnbarken, använder både in vivo tillvägagångssätt och neuronala kulturer från gnagare vävnader. Neuropatologiska tillstånd kan vara associerade till förändrad ryggraden induktion och mognad, såsom visas i gnagare odlade neuroner och en-dimensionell kvantitativ analys 1. Den aktuella studien beskriver ett protokoll för 3D-kvantitativ analys av ryggraden morfologier användning av humant cortical neuroner härledda från neurala stamceller (sena kortikala stamceller). Dessa celler ursprungligen erhölls från inducerade pluripotenta stamceller. Detta protokoll möjliggör analys av ryggraden morfologier på olika odlingsperioder, och med eventuell jämförelse mellan inducerade pluripotenta stamceller som erhållits från kontrollindivider med de som erhållits från patienter med psykiatriska sjukdomar.

<html> Föreliggande studie beskriver ett standardiserat protokoll för ryggrad kvantifiering av odlade dendriterna i pyramidala neuron härledda från iPSC. Detta protokoll möjliggör analys av ryggraden mognad om mänskliga nervceller och dess eventuella jämförelse med mognaden av taggar i standard gnagare neuronala kulturer samt i in vivo djurmodeller. Figur 1A representerar ett schema för de olika stegen i kultur som medger produktion av kortikala pyramidala ...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritutskotten av pyramidala nervceller är platserna för de flesta excitatoriska synapser i däggdjurs hjärnbarken. Denna metod beskriver en 3D kvantitativ analys av rygg morfologier i humana kortikala pyramidala glutamaterga neuroner som härrör från inducerade pluripotenta stamceller.

Tredimensionell Kvantifiering av Dendritutskotten från Pyramidal nervceller Härstammar från Human inducerade pluripotenta stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation Integrations- fria Human inducerade pluripotenta stamceller Använda Hair-härledda Keratinocyter

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fria Derivering av Melanocyter från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från humant melanom tumörinfiltrerande lymfocyter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differentierande kondrocyter från perifert blod härledda humana inducerade plöripotenta stamceller

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsbildning från Cord Blood-härledda inducerade Pluripotenta stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Synaptic resonanskrets modellering med 3D Cocultures av astrocyter och nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av 3D hud Organoid från sladd blod-derived inducerade pluripotenta stamceller

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

Serum fri produktion av tredimensionella humana Hepatosfärer från pluripotenta stamceller

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...