Name: whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments
Uploaded: 2015-09-30T15:00:00
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The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

このプロトコルは、「ビジョンと眼科での研究のための協会の実験動物の管理と使用に関する指針」の推奨事項に従って行われます。 1.卵取り扱いとアイコレクション<ol><li> 1週間以上、もはや用に12〜14℃の白色レグホン卵を保管してください。可能な場合は、受精卵を保存する冷蔵ワインクーラーを使用しています。 注意：より低い温度では死亡率を増加させな...

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina.">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina.">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors.">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li><li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway.">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li><li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest.">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li></ol>

この作品では、切開、エレクトロポレーションまたは化学的処理、およびニワトリ胚からの全体の網膜の外植片を培養するための詳細なプロトコルが提示されています。このプロトコルは、迅速、簡単であり、高い成功率と再現性の両方を可能にします 結果。 全網膜外植片のエレクトロポレーションは、対象の遺伝子構築物を発現する細胞の大部分を生成?...

網膜は中枢神経系の一部であり、その相対的な簡単さと十分に特徴付け細胞構造、中枢神経系の発達を研究するための人気のあるモデルです。ニワトリ胚の眼は、胚の残りの部分に比べて相対的に大きいです。従って、このような注射またはエレクトロポレーションなどの実験操作のための卵内に容易にアクセスでき、網膜細胞や生体内で発生生物学に関する知識を得るための優れたツールとして機能します。実験は、エレクトロポレーション、反復注射、または組み合わせた実験操作と同様に侵襲的であるとき、これらの主要な利点にもかかわらず、胚の生存率は低くすることができます。 卵内ニワトリ胚へのDNAプラスミドのエレクトロポレーションは重要であり、十分に確立された技術1です。これは、神経細胞の標識化を可能にする細胞の運命の追跡だけでなく、中央NERVにおける神経管OUのシステムは、それがインビボでタンパク質機能を解析するための異所性の遺伝子発現を可能にします。技術は、3後脳、および4網膜、神経管2の研究のために使用されてきました。 卵内胚網膜のエレクトロポレーションは、in vivoでの状況に関連したいくつかの実験の困難を持っています。胚の頭蓋折りたたみに起因する目の位置は、心臓に比較的近いです。この接近は、エレクトロポレーション後の心停止のリスク、および胚の年齢とともにリスク増加が増加します。また、目にアクセスするために、それによって出血、奇形およびその後の生存率減少のリスクを増加させる、胚の膜を開くことが必要です。既知の表現型の結果なしで、多くの場合、新たなDNAプラスミドをテストし、最適化する場合、これらの制限はあっても、経験豊富な実験者のための方法の有効性とパワーを減少させることができます。このプロトコルは、Wの文化の中で提示したよう削除色素上皮と神経網膜全体として形成された孔網膜外植は、OVOのアプローチで補完する効率的な方法です。 化学試薬の眼内注射は 、OVO で実行するのが比較的容易です。しかし、神経網膜内注射、試薬の有効かつ正確な濃度は、完全に制御することが困難な場合があります。注入量は、漏れに変えることができ、注射の正確な部位は、眼内の試薬の分布と硝子体を通して拡散の両方に影響を与える可能性があります。酵素阻害剤のための、すなわち、用量応答曲線を決定する際の変動は、結果の解釈のために主要な影響を有することになります。特に効果が小さく、効果の時間窓が狭い場合。血流を介し潜在的な全身作用のために、OVOの実験で行うときにまた、唯一の目には、各胚から使用することができます反対側の眼へ。開発および処置および対照胚は、追加実験の変動につながる可能性の間の個体差を検討する際に年齢のマッチングが重要です。 これらの理由のために、ニワトリ胚の網膜外植片に基づく方法卵EXは、神経網膜を均一に露出し、 インビトロで実験条件を制御することが可能で、開発されました。現在のプロトコルは、以前のプロトコル5-9に基づいて開発されました。ステージからの網膜外植体（ST）、ST31〜20（3胚日[E]）は、（E7）は、ニワトリ胚を培養し、解剖し、エレクトロポレーション定義DNAプラスミドの濃度または化学試薬の規定された濃度を含有する培地に曝露しました。ここで紹介するプロトコルは成功し、このようなKU55933、SB 218078、およびNSC 109555 DITOなどのDNA損傷経路の調節因子を含む、いくつかの異なる化学試薬を使用して、最近の出版物に実装されましたこのようするCdk1 / 2阻害剤III 10,11としてsylate、および細胞周期、。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1xPBS (tablet)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18912-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10xDPBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14080-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable plastic cuvette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8495V01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td>1054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/2 inhibitor III</td>
			<td>217714</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300nM in 0.01% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Platina, custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro square porator ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>0108-5-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium NEG50</td>
			<td>Cellab, Sweden</td>
			<td>6502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td>
			<td>8204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1214P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way embedding mold&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphoHistone 3 (PH3)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Dilution 1/4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes (custom made from &#34;rondelles&#34;)</td>
			<td>Sargenta</td>
			<td>390-R (rondeller)</td>
			<td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platimun electrodes&#160;</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Dia: 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-2853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spoon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-2151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443815S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Leghorn eggs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Local supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wine cooler</td>
			<td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

網膜は、発展途上の中枢神経系のための優れたモデルです。 OVO / in vivoでの実験操作のための目のサイズが大きいと、最も重要なアクセシビリティ鶏胚網膜汎用性と非常に効率的な実験モデルを作成します。鶏の網膜は眼内注射またはエレクトロポレーションによって卵内標的にするのは簡単ですが、網膜内の試薬 ​​の効果的かつ正確な濃度は、完全に制御することが困難な場合があります。これは、眼または物質の不均一な拡散の正確な注射部位、漏れの変動に起因し得ます。さらに、このようなエレクトロポレーションなどの侵襲的な操作後の奇形や死亡の頻度はかなり高いです。 このプロトコルは、ニワトリ胚から全網膜の外植片を培養する技術OVO EXを記述し、試薬に網膜の制御された露光のための方法を提供します。プロトcolが実験的に、解剖操作、ニワトリ胚の培養全体の網膜の外植する方法について説明します。外植片は、約24時間培養することができ、例えば、エレクトロポレーションのような別の操作に付すこと。主な利点は、実験は、胚の生存に導入試薬の濃度を変化させると効果的な濃度を決定し、最適化するために制御することができる依存しないことです。さらに、この技術は、その高い実験成功率とともに、迅速、安価であり、それは再現性を保証します 結果。それは卵内行われた実験に優れた補完するものとして機能していることを強調すべきです。

このプロトコルは、ニワトリ胚からの全体の網膜の外植片の準備（ 図1A-F）および培養について説明します。このプロトコルが正常にST31にST20（E3）の胚からの全体の網膜外植（E7）のために使用されています。 全網膜外植片へのDNAプラスミドのエレクトロポレーションは、網膜前駆細胞の標識および追跡のためにまたは過剰発現の異なる遺伝子産物のことが?...

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Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

このプロトコルは、解剖実験的に操作し、ニワトリ胚の培養全体の網膜外植する方法について説明します。高い成功率、有効性と再現性をエレクトロポレーションおよび/ ​​または試薬物質、 すなわち、酵素阻害剤のためのプラスミドの効果をテストするために必要な場合、外植片培養は便利です。

エレクトロポレーションおよび化学試薬の治療のための鶏胚からの全網膜の外植片

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

鶏の胚内の神経堤細胞と血管の二重標識は、ひよこGFP 神経管移植とカルボシアニンDyI注射を用いた

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...