Name: sensitive detection of proteopathic seeding activity with fret flow cytometry
Uploaded: 2015-12-08T13:00:00
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This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).

नोट: इस प्रोटोकॉल झल्लाहट का उपयोग माउस जैविक नमूने से बोने गतिविधि का पता लगाने के लिए प्रवाह cytometry पर जोर दिया। यह भी पुनः संयोजक तंतु और मानव जैविक नमूनों के साथ संगत है। माउस इच्छामृत्यु और मस्तिष्क कटाई IACUC-अ?...

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	<li>Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases+target+large-scale+human+brain+networks.">Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks.</a> Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).</li><li>Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Regional+Neurodegeneration+from+the+Healthy+Brain+Functional+Connectome.">Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome.</a> Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).</li><li>Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Diffusion+Model+of+Disease+Progression+in+Dementia.">A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia.</a> Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+Alzheimer's+disease-related+neurofibrillary+changes.">Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes.</a> Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).</li><li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases.">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+protein+aggregate+propagation.">Cellular mechanisms of protein aggregate propagation.</a> Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).</li><li>Kaufman, S. K., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+protein+aggregation+and+related+therapeutic+strategies.">Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies.</a> Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).</li><li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+properties+of+Tau+protein:+the+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target.">Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li><li>Guo, J. L., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transmission+of+pathogenic+proteins+in+neurodegenerative+diseases.">Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).</li><li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell.">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).</li><li>Guo, J. L., Lee, V. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeding+of+normal+tau+by+pathological+tau+conformers+drives+pathogenesis+of+Alzheimer-like+tangles.">Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2011).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+internalization+and+propagation+of+specific+proteopathic+seeds.">Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).</li><li>de Calignon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+Tau+Pathology+in+a+Model+of+Early+Alzheimer's+Disease.">Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease.</a> Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Synaptic+Spread+of+Tau+Pathology+In+Vivo.">Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).</li><li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo.">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 .</li><li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model.">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. 65 (65), (2012).</li><li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse.">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li><li>Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+prion+protein+bound+to+stainless+steel+wires:+a+model+for+testing+decontamination+procedures+for+transmissible+spongiform+encephalopathies.">Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).</li><li>McDonnell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning,+disinfection+and+sterilization+of+surface+prion+contamination.">Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination.</a> J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).</li><li>Banning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+FRET+assay+to+identify+and+analyse+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells.</a> PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).</li><li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer's+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein.">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein.">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537 (2015).</li></ol>

यहाँ वर्णित झल्लाहट प्रवाह cytometry प्रणाली जल्दी और मात्रात्मक ताऊ बोने गतिविधि का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह केवल मध्यम सेल संस्कृति का अनुभव है और झल्लाहट का कार्यसाधक ज्ञान और प्रवाह cyt...

इंट्रासेल्युलर ताऊ amyloids का संचय अल्जाइमर रोग के रूप में tauopathies परिभाषित करता है। जल्दी रोग के चरणों में, पैथोलॉजी आम तौर पर मस्तिष्क की असतत क्षेत्रों के लिए स्थानीय है, लेकिन रोग प्रगति के साथ, पैथोलॉजी निरपवाद रूप से अलग तंत्रिका नेटवर्क 1-5 के साथ फैलता है। जमते सबूत जहरीले प्रोटीन समुच्चय के transcellular प्रचार (6-10 में समीक्षा) इस विकृति के पीछे भी यही पता चलता है। इस मॉडल में, proteopathic बीज (जैसे, ताऊ) दाता कोशिकाओं से जारी कर रहे हैं और templated गठनात्मक परिवर्तन 11-15 के माध्यम से misfolded रूप में देशी ताऊ प्रोटीन बदलने, कोशिकाओं पड़ोसी दर्ज करें। यहाँ वर्णित परख संवेदनशीलता ऐसे बोने गतिविधि का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था। यह पुनः संयोजक प्रोटीन और जैविक नमूनों के साथ संगत है और proteopathic बोने गतिविधि 16 मिनट के स्तर की मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है। स्थिरतापूर्वक ताऊ दोहराने घ कि एक्सप्रेस HEK 293T कोशिकाओंसीएफपी या YFP या तो के लिए जुड़े हुए रोग से जुड़े P301S उत्परिवर्तन युक्त omain (आरडी) बोने गतिविधि का एक स्थिर biosensor के रूप में सेवा कर (इसके बाद ताऊ-आरडी सीएफपी / YFP कोशिकाओं के रूप में करने के लिए कहा गया है)। Proteopathic बीज के अभाव में, कोशिकाओं को एक घुलनशील मोनोमर के रूप में ताऊ बनाए रखने, और कोई सराहनीय पृष्ठभूमि झल्लाहट है। कोशिकाओं में उठना, तेज या ताऊ बीज की liposome की मध्यस्थता पारगमन, हालांकि, प्रवाह cytometry के माध्यम से एकल कक्षों के भीतर मापा जाता है कि एक संकेत झल्लाहट पैदा करता है जो आरडी सीएफपी और आरडी-YFP एकत्रीकरण, में परिणाम है। इस परख के कई घटकों के प्रति संवेदनशीलता बढ़ाने और परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए इंजीनियर थे। एक 1 के साथ एक मोनोक्लोनल सेल लाइन: यह इष्टतम संकेत देता है के रूप में एक आरडी सीएफपी / YFP अभिव्यक्ति अनुपात, चयनित किया गया था: शोर। संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए, फॉस्फोलिपिड सीधे कोशिकाओं में बीज को पेश करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं (तेज की जैविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए हालांकि, इस छोड़ा जा सकता है)। अंत में, एक जनसंख्या के स्तर पर और एक एकल कोशिका पर नज़र रखता है झल्लाहट प्रवाह cytometry<html> स्तर, अन्य प्रोटीन एकत्रीकरण assays के विपरीत है। अंतिम परिणाम उपाय, एकीकृत झल्लाहट घनत्व, अत्यधिक मात्रात्मक और एकत्रीकरण के साथ कोशिकाओं की संख्या, और एकत्रीकरण प्रत्येक कोशिका के भीतर हुई है, जो करने के लिए डिग्री के लिए दोनों खातों। इन अनुकूलित मापदंडों के सभी संवेदनशीलता बढ़ाने और reproducibility किया जाता है। इस प्रणाली को हाल ही में अन्य आमतौर पर इस्तेमाल ताऊ रोग मार्करों के लिए अस्थायी शुरुआत और ताऊ बोने गतिविधि रिश्तेदार की प्रगति (जैसे, MC1, AT8, PG5, और ThioflavinS) का मूल्यांकन किया है कि ट्रांसजेनिक P301S tauopathy चूहों 17 में एक व्यापक अध्ययन में कार्यरत था। सीडिंग गतिविधि के द्वारा अब तक कम से कम 6 सप्ताह से ऊतकीय का पता लगाने से ठीक पहले का मूल्यांकन ताऊ विकृति की जल्द से जल्द और सबसे मजबूत मार्कर है। सीडिंग गतिविधि शुरू होने और / या neurodegeneration 16 की प्रगति में proteopathic बीज का एक कारण भूमिका, सुझाव 1.5 महीने और उत्तरोत्तर उम्र के साथ बढ़ जाती है पर दिखाई देता है। e_content &quot;&gt; जैविक नमूने से बीज सामग्री के मिनट के स्तर के सटीक quantitation। जल्दी रोग प्रगति पर नजर रखने कि अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं परीक्षण अवधि को छोटा और छोटे जानवरों के उपयोग को सक्षम करने से, यह प्रीक्लीनिकल पशु परीक्षणों की क्षमता और सटीकता बढ़ सकते हैं। उदाहरण के लिए, में P301S माउस पहले वर्णित, नेतृत्व यौगिकों जल्दी 4-6 सप्ताह के रूप में के रूप में दिया जा सकता है, और 2-4 हफ्ते बाद प्रभावकारिता के लिए नजर रखी। परख सही बोने में कोई कटौती यों चाहिए (या बोने गतिविधि की शुरुआत में करने के तुरंत पहले) गतिविधि। cytometry इन विट्रो स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के रूप में अच्छी तरह से। उदाहरण के लिए, विरोधी ताऊ अभिकर्मकों (जैसे, एंटीबॉडी, छोटे अणुओं, आदि) या तो पुनः संयोजक ताऊ का उपयोग कर, संस्कृति में सीधे प्रेरण बोने ब्लॉक करने के लिए उनकी क्षमता के लिए तेजी से परीक्षण किया जा सकता है प्रवाह झल्लाहट एक बीज स्रोत (चित्रा 5)। इस सेटअप के साथ, बीज सामग्री तैयार किया जाता है, एक बार एक पूर्व के रूप में समुच्चय या मस्तिष्क व्युत्पन्न lysatesperiment डेटा विश्लेषण सहित पूरा करने के लिए सिर्फ तीन दिन लगते हैं। proteopathic बोने गतिविधि के तेजी से quantitation के इस प्रकार neurodegeneration के कई अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XSE 105DU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-735-743</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>18-000-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>OR-T-156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noise Cancelling Ear Muffs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-145-412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S47299</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 000.215</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SS-PH15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL reagent resevoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>41428-954</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi channel pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TI13-690-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 40 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOLiner Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-116</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 96 Rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-459</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo analysis software</td>
			<td>Flow Jo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL pipet tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL pipet tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-606180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-607180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipett</td>
			<td>Phenix Research</td>
			<td>SPG-760180</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensitive detection of proteopathic seeding activity with fret flow cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

झल्लाहट प्रवाह cytometry संवेदनशील, मात्रात्मक, और पुनः संयोजक या जैविक नमूने से बोने गतिविधि का तेजी से पता लगाने में सक्षम बनाता है। परख सेटअप सतही है: ताऊ-आरडी सीएफपी / YFP व्यक्त मोनोक्लोनल व्युत्पन्न स्थि...

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Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

झल्लाहट फ्लो के साथ Proteopathic सीडिंग गतिविधि के संवेदनशील पता लगाने

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Research

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