Name: purification of mouse brain vessels
Uploaded: 2015-11-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Mouse Brain Vessels at JoVE.com

Эта работа была поддержана Labex MemoLife и по ARSEP (Фонд Pour l&#39;помощник а-ля Recherche сюр-ла-уплотнять ан бляшек)

1. Решения и материалы <ol><li> Готовят растворы выделение сосудов: В1, добавить 1,5 мл 1М HEPES 150 мл HBSS; В2, добавить 3,6 г декстрана 20 мл B1; В3, добавляют 1 г БСА на 100 мл B1. </li><li> Измените держатель фильтра путем разрезания дна от верхней части завинчивания. </li><li> Подготовка Иммуноокрашивание решения...

Барьер гематоэнцефалический регулирует прохождение физиологических веществ в и из ЦНС и защищает его от потенциально вредных веществ, присутствующих в крови. Он участвует в нескольких патологий ЦНС, в том числе нейродегенеративных заболеваний 2 и опухолей головного мозга 28.</...

Правильная работа центральной нервной системы (ЦНС) требует высокой регулируемой внеклеточной среде, и его метаболических потребностей огромны по сравнению с другими органами 1. ЦНС также очень чувствительны к широкому спектру химических веществ, как правило, безвредным для периферических органов, но к ней, нейротоксическое. Для обеспечения правильного функционирования, большинство из &quot;сосудистой ЦНС образует барьер эндотелиальных; гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который регулирует поток молекул и ионов, а также прохождение иммунных клеток между кровью и мозгом, тем самым поддерживая надлежащую гомеостаз 2, но также ограничивает проникновение лекарственных препаратов, тем самым, препятствуя лечения неврологических расстройств. 3 На клеточном уровне, то ВВВ в основном поддерживается обширными плотных контактов между эндотелиальными клетками, поляризованного экспрессии оттока транспортеров и с очень низкой скоростью трансцитоза 4. Свойства и функции ГЭБ, в основном индуцируется пеighboring клетки 4. В частности, перицитов играют важную роль в стимулирования и поддержания ГЭБ 5,6. Будучи сократительных клеток, перициты также регулировать кровоток 7, как это делают клетки гладких мышц, окружающие крупные сосуды. Наконец, астроциты, основные глиальные клетки головного мозга, передавать большие процессы с именем endfeet вокруг большей части головного мозга сосудистой 8 и модулировать целостность ВВВ и иммунной состояние покоя 9, передачу метаболитов к нейронам 10, и индуцируют жесткую связь между нейронной активности и кровоток 11,12. Возможность изучать молекулярные и клеточные свойства цереброваскулярной системы имеет решающее значение для характеристики лучше свой вклад в физиологии мозга и патофизиологии. Для решения этого вопроса, стратегии изолировать цереброваскулярные системы мозга были разработаны, которые позволяют для подготовки неповрежденных фрагментов мозга сосудов. Церебральный судно рurification изначально описывается с помощью крупного рогатого мозги 13 и улучшены и адаптированы к другим видам, в частности грызунов 14. В этом последнем исследовании, была введена использование фильтров разных размеров, чтобы отделить сосуды головного мозга, чтобы фракции, обогащенные в сосудах разного диаметра. Интересно, что в таких препаратах, эндотелиальные клетки сохранили свои метаболические свойства 15, функциональность транспортер 16 и поляризационные 17. Здесь мы подробно этот протокол и далее показывают, что изолированные сосуды сохраняют большинство своих наблюдений в точке структур. Эндотелиальные клетки остаются связаны плотных контактов и окружен непрерывной базальной мембраны. Перициты и гладкомышечные клетки остаются прикрепленными к эндотелиальный слой, а также периваскулярными астроцитов мембран. Тем не менее, астроциты, клетки микроглии, нейроны и олигодендроциты устранены. Наконец, мы описываем процедуру выполнять иммуноокрашивания на изолированных сосудов головного мозга. </р&gt; До сих пор большинство из молекулярных и клеточных исследований, касающихся цереброваскулярные системы не были выполнены на очищенных клеток головного мозга судов диссоциированных по мобильному сортировки с использованием конкретных штаммов репортер клеток мыши или процедуры Иммуноокрашивание основе 18,19. Хотя эти методы позволяют для выделения почти чистых популяций клеток цереброваскулярных, изолированные клетки полностью теряют на месте морфологию и взаимодействий, которые, в свою очередь, в значительной степени влияет на их молекулярные и клеточные свойства. Протокол, описанный здесь позволяет для выделения целых цереброваскулярных фрагментов без необходимости специфических антител или трансгенных мышей пятен, предлагает хорошую альтернативу в качестве общей структуры изолированных сосудов головного мозга сохраняется, таким образом, уменьшая воздействие на их молекулярных свойств. Изолированные сосуды затем могут быть использованы для изучения активности генов, синтез белка и регулирования в BBB качестве недавно описал 20,21 </suр&gt;. Наконец, по сравнению с лазерной захвата микродиссекции 22,23 Настоящий Протокол является недорогой, легко выполнять и быстро адаптируется к любому лаборатории.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Grinder Size C</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>3431E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5415&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance, Modular Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact System Provides High Quality Leica LED1000</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low binding tips (P1000)</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>14200T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 20&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 100&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1014356290F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips, Thickness 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P10143263NR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;PARAFILM&#174; M (roll size 4 in. &#215; 125 ft)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Life technology</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>ET330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&#174; 488 Conjugate; Dilution 1/100</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (rabbit) ; dilution 1/400</td>
			<td colspan="2">kindly provided by Dr Markus A Ruegg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>33-9100</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti GFAP (mouse, clone GA5)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3893</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti AQP4 (rabbit)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Cx43 (mouse, Clone&#160; 2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610061</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Olig2 (rabbit)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>&#160;dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NF-M (mouse)</td>
			<td colspan="2">provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.</td>
			<td>&#160;dilution 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Iba1 (rabbit)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>&#160;dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11029</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11034</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21424</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 555 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21429</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of mouse brain vessels

В головном мозге, большинство из сосудистой системы состоит из селективного барьера гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который регулирует обмен молекул и клеток иммунной системы между головным мозгом и кровью. Кроме того, огромный спрос нейронов метаболический требует регулирования момента к моменту кровотока. Примечательно, нарушения этих регулировок этиологические признаки большинства патологий головного мозга; в том числе глиобластомы, инсульт, отек, эпилепсия, дегенеративных заболеваний (например: болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера), опухоли головного мозга, а также воспалительных заболеваний, таких как рассеянный склероз, менингит и сепсис-индуцированной дисфункции мозга. Таким образом, понимание сигнализации события модуляции цереброваскулярные физиологии является серьезной проблемой. Большая понимание клеточных и молекулярных свойств различных типов клеток, которые составляют систему цереброваскулярные могут быть получены от первичной культуры или сортировки клеток из свежего диссоциированного мозговой ткани. Однако,свойства, такие как клеточной полярности, морфологии и межклеточных отношений не поддерживается в таких препаратах. Протокол, который мы здесь описывать предназначен для очистки фрагментов мозга сосудов, сохраняя структурную целостность. Покажем, что изолированные сосуды состоят из эндотелиальных клеток, герметично плотных контактов, которые окружены непрерывной базальной пластинки. Перициты, гладкомышечные клетки, а также периваскулярные астроцитов endfeet мембраны остаются прикрепленными к эндотелиальный слой. Наконец, мы опишем, как выполнять Иммуноокрашивание эксперименты на очищенных сосудов головного мозга.

Здесь мы опишем протокол, позволяющий для механической изоляции сосудов головного мозга 14. Рисунок 1 суммирует основные этапы этого метода. Архитектура сосудов головного мозга является сложным и включает в себя несколько типов клеток, т.е., эндотелиальные клетки, за...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Mouse Brain Vessels at JoVE.com

Purification of Mouse Brain Vessels

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Очистка сосудов головного мозга мыши

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Подготовка ткани мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Несколько мыши нейроанатомической Магнитно-резонансная томография

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Многофотонной микроскопии Сбрасывается мозга мыши выражая YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Всего монтажа Визуализация эмбриона мыши Сенсорная Axon прогнозам

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Крупномасштабные трехмерных изображений клеточной организации коры головного мозга мыши

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Производства, очистки и контроля качества для аденоассоциированный вирус основе векторов

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Очистка дендритной филоподии богатой фракцией

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Очистка Проминина-1- Стволовые клетки от постнатального мышиного церебеллума

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Острый мышь мозга нарезки для расследования спонтанной деятельности гиппокампа сети

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Горизонтальные гиппокампа ломтики мыши мозга

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...