Name: microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery
Uploaded: 2015-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery at JoVE.com

Esta obra fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL44485 y HL28607.

Declaración de Ética: Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional. 1. Fabricación preliminar de Micropipetas, inmovilización y bloqueadores <ol><li> Tire varios tubos capilares de vidrio de borosilicato limpias en un medio con un extractor electrónica ajustado de manera que, cuando se tira, la porción estirada del tubo es de aproximadamente 1 cm de longitud y las dos mitades son algo simétrica. Asegúrese de q...

Los detalles de los cálculos PL. Aunque el movimiento del fluido transvascular ocurre mientras el buque está libremente perfundido, dicho intercambio es demasiado pequeña para ser medida durante la perfusión libre porque es típicamente menos de 0,01% de la tasa de perfusión buque. Sin embargo, cuando la perfusión se detiene transitoriamente mediante la oclusión de la microvasos, el flujo de transvascular (es decir, la filtración) se mide desde el movimiento de las células rojas de ...

Microperfusión en la vasculatura conlleva establecer el flujo de un líquido de perfusión artificial de composición conocida controla a través de una micropipeta en un vaso sanguíneo por lo general menos de 40 micras de diámetro. El recipiente de perfundido se mantiene dentro de su entorno de tejido normal y es perfundido con la sangre del animal hasta el momento de la canulación. Cuando se utiliza junto con una serie de imágenes de vídeo o técnicas fluorométricos, en microperfusión situ permite la medición de los flujos de agua y de solutos a través de las paredes de los microvasos en condiciones donde se sabe que las fuerzas de conducción para estos flujos y las propiedades de permeabilidad de la pared vascular pueden ser directamente evaluado. Además, mediante el control de la composición del líquido que rodea al de los microvasos en el tejido (perfundido y superperfundido), la regulación de la permeabilidad microvascular y el intercambio se puede investigar al permitir que las células endoteliales que forman la pared de los microvasos de estar expuestos a una variedad de correocondiciones Xperimental (agonistas, condiciones de perfusión modificados, indicadores fluorescentes para medir la composición intracelular y la señalización) durante períodos medidos con precisión de tiempo (seg a hr). Además, las evaluaciones ultraestructurales o citoquímicos de estructuras moleculares celulares clave que regulan la barrera se pueden investigar en los mismos microvasos en el que se mide directamente la permeabilidad. El enfoque de esta manera forma un puente entre la investigación de los mecanismos celulares y moleculares para modificar la función de barrera endotelial en cultivos de monocapas de células endoteliales y la investigación en microvasos intactos. Ver las siguientes revisiones para evaluación adicional 1-6. Una limitación de microperfusión es que sólo se puede utilizar en lechos microvasculares que son delgadas, transparentes y tienen una integridad estructural suficiente para permitir la canulación con una micropipeta de vidrio. Mientras que las primeras investigaciones utilizan microvasos rana en el mesenterio y delgado cutánea angina de muscle 7,8, con mucho, la preparación más comúnmente utilizado en los modelos de mamíferos es el mesenterio de rata 9-15. La mayoría de las investigaciones se han centrado en los cambios agudos en la permeabilidad vascular estudiado durante períodos de 1-4 horas, pero las investigaciones más recientes se han extendido a las mediciones en los buques individuales de 24-72 hr después de una perfusión inicial 12,16. La tecnología CRISPR recientemente desarrollado, que promete hacer modelos de ratas modificadas genéticamente más disponibles para el estudio de la regulación de la permeabilidad vascular 17 debería permitir a los métodos descritos en esta comunicación que se aplicarán en los microvasos venulares del mesenterio en estos importantes nuevos modelos de rata. El método requiere un microscopio invertido equipado con una platina del microscopio a la medida lo suficientemente grande como para contener tanto la preparación de los animales y al menos tres micromanipuladores utilizado para microherramientas posición cerca de la embarcación perfundido y para alinear una micropipeta perfusión con el buquelumen. Por ejemplo, una plataforma personalizada para una platina del microscopio xy (alrededor de 90 × 60 cm) puede fabricarse a partir de una placa de acero 1 cm de espesor con un revestimiento a prueba de herrumbre. La etapa está unido a una tabla de índices de ingeniería o dos diapositivas en cola de milano montados en ángulos rectos y apoyadas sobre pilares de teflón o transferencias de bolas para el movimiento en el plano horizontal. Una plataforma típica (véase la figura 2) tiene mucho en común con el equipo de microscopio y microposicionamiento utilizado para una serie de experimentos microcirculación intravital como los que para medir el flujo único de los vasos sanguíneos y el hematocrito, el suministro de oxígeno local microvasos sanguíneos perfundidos, la regulación de liso vascular el tono muscular y la acumulación microvascular local de los trazadores fluorescentes inyectados en toda la circulación. 18-26 El aspecto fundamental de la técnica es la medición del flujo de volumen (v J) a través de un área de superficie definida (S) de la pared de los microvasos. Para llevar a caboesto a través de la técnica de Landis modificado descrito en el presente documento un sencillo microscopio invertido es adecuada. Una cámara de video pequeña está montado en el puerto de imagen y la señal de vídeo, con una base de tiempo de descuento, se visualiza en un monitor de video y grabado, ya sea en forma digital en un ordenador o como una señal digital o analógica en una grabadora de vídeo. Una vez que el microvasos se canula la porción de la microvasos visible a la cámara se puede cambiar moviendo el escenario y manipuladores como una unidad sin alterar la canulación. Medición de los flujos de transvascular también se puede combinar con las investigaciones más detalladas utilizando un microscopio de fluorescencia sofisticado con filtros adecuados tales como equipos de perforación utilizados para las mediciones de permeabilidad soluto, monitoreo relación fluorescente de calcio citoplasmático u otros mecanismos celulares, y de formación de imágenes confocal 6,12,13, 27. Una ventaja clave de todos los enfoques microperfusión es la capacidad de tomar medidas repetidas, en el mismo buque, En la variación controlada de fuerza motriz, como presiones hidrostáticas y oncóticos o cambio inducido en las respuestas de los buques a las condiciones inflamatorias. El diseño más común es una comparación emparejada de la conductividad hidráulica medida (L p) en el mismo recipiente con el recipiente primero perfundido a través de una micropipeta llena de un líquido de perfusión de control y la suspensión de glóbulos rojos para establecer un estado permeabilidad línea de base, a continuación, con una segunda pipeta con el agente de prueba añadido al perfundido. Múltiples canulaciones son posibles con el ciclo se repite después de la reperfusión con la pipeta de control. El presente protocolo demuestra la canulación y microperfusión de un vaso venular en mesenterio de rata para grabar flujos de agua a través de la pared de microvasos y medir la L p de la pared del vaso, un índice útil de la permeabilidad de la vía común para el agua y solutos a través de la intacto barrera endotelial. El procedimiento se denomina techniq Landis modificadoue porque el principio Landis original de utilizar el movimiento relativo de los glóbulos rojos como una medida de intercambio de fluido transvascular después de la perfusión está bloqueado se conserva 28, pero la gama de condiciones experimentales (por ejemplo, las diferencias de la presión oncótica hidrostáticas y de albúmina a través de la pared de los microvasos) disponible después microperfusión es mucho mayor que en la sangre perfundida microvasos uncannulated 8,29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK-40</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow diameter, long working distance objective: example</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon E Plan 10&#215;/0.25 LWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td>
			<td>welding shop</td>
			<td></td>
			<td>this should be heavy to reduce vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unislide x-y table: dove tail slides</td>
			<td>Velmex</td>
			<td>AXY4006W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIDEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD video camera: example</td>
			<td>Pulnix</td>
			<td>TM-7CN (no longer available)</td>
			<td>no color needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video capture system with audio--generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small microphone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator, XYZ (3)</td>
			<td>Prior/Stoelting (no longer available)</td>
			<td></td>
			<td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydraulic probe drive, one way</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-1C</td>
			<td>need to buy either manual drive or electronic drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manual drum drive&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-9-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or hydraulic drive, 3 way</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td>
			<td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors/rods/holders</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MXC-2.5, MXB etc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin vise</td>
			<td>Starrett</td>
			<td>162C</td>
			<td>to hold restrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>World Prescision Instruments</td>
			<td>MPH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water manometer ~120 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE TRAY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td>
			<td>Quartz Scientific Inc.</td>
			<td>custom</td>
			<td>&#160;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical adhesive for tissue well</td>
			<td>NuSil</td>
			<td>MED-1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&#34; L x 2&#34; W</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03125-20</td>
			<td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-01575-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET MANUFACTURE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-30 with nichrome filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RX Honing Machine, System II</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td>MAC-10700 Rx System II Machine</td>
			<td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; with ceramic sharpening disc</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td></td>
			<td>use &#34;as is&#34; or attach lapping film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td>
			<td>3M</td>
			<td>part no. 051144 80827</td>
			<td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

Experimentos para medir las propiedades de permeabilidad de microvasos perfundidos individualmente proporcionan un puente entre la investigación de los mecanismos moleculares y celulares que regulan la permeabilidad vascular en cultivos de monocapas de células endoteliales y las propiedades de intercambio funcionales de camas microvasculares enteros. Un método para canular y perfundir microvasos venulares de mesenterio de rata y medir la conductividad hidráulica de la pared de microvasos se describe. El equipo principal necesaria incluye un microscopio intravital con una etapa modificado grande que soporta micromanipuladores para posicionar tres Microtools diferentes: (1) una micropipeta de cristal biselado para canular y perfundir el microvasos; (2) un micro-oclusor de vidrio para bloquear transitoriamente la perfusión y permitir la medición de movimiento de circulación de agua transvascular a una presión hidrostática medido, y (3) una varilla de vidrio contundente para estabilizar el tejido mesentérico en el sitio de canulación. El Landis micro-oclusión techniq modificadoue utiliza glóbulos rojos suspendidos en el líquido de perfusión artificial como marcadores de movimiento de fluidos transvascular, y también permite mediciones repetidas de estos flujos condiciones experimentales se cambian y la diferencia de presión osmótica hidrostática y coloidal a través de los microvasos se controlan cuidadosamente. Las mediciones de la conductividad hidráulica primero utilizando un perfundido control, a continuación, después de volver a la canulación de la misma con los microvasos perfundidos de prueba permitir comparaciones de la respuesta de los microvasos bajo estas condiciones bien controladas emparejados. Los intentos de extender el método a los microvasos en el mesenterio de ratones con modificaciones genéticas esperados para modificar la permeabilidad vascular fueron severamente limitadas debido a la ausencia de largas microvasos rectas y no ramificados en el mesenterio ratón, pero la reciente disponibilidad de las ratas con modificaciones genéticas similares utilizando Se espera que la tecnología / Cas9 CRISPR para abrir nuevas áreas de investigación en que los métodos descritos en el presente documento pueden aplicarse. </p&gt;

La Figura 4 muestra los resultados de la medición de la evolución temporal de los cambios en L p en una rata venular microvasos canulado sucesivamente con cuatro perfundidos. 33 La magnitud de L p calculado a una presión constante se usó como una medida de los cambios en la permeabilidad de la pared de los microvasos, primero en el estado de control con un líquido de perfusión que contiene 1% de albúmina de suero bovino a continuación, cuando el recipiente se exp...

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Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

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