Name: in vitro generation of murine plasmacytoid dendritic cells from common lymphoid progenitors using the ac-6 feeder system
Uploaded: 2015-11-23T17:00:00
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私たちは、博士に感謝しています。試薬を提供するためのマルクス・マンツとアービングワイズマン。我々はまた、それぞれ、フローサイトメトリー分析によって提供されるサービスとファーストと医学の国立台湾大学で第二のコア研究所とNTU病院の細胞選別基盤施設を認めます。この作品は、科学技術省、台湾（MOST 102から2320-B-002から030-MY3）と国民健康研究所、台湾（NHRI-EX102-10256SIとNHRI-EX103-10256SI）によってサポートされていました。

C57BL / 6野生型マウスは、国立実験動物センター（NLAC）、台湾から購入しました。すべてのマウスは、特定病原体を含まない条件下で飼育し、維持しました。プロトコルおよび動物使用手順を見直し、医学の国立台湾大学（許可番号：20120075）の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。実験を行っている間に加えて、研究者は、動物のすべての痛みの可能性を減らすため、苦痛、または苦痛を行...

<ol>
	<li>Hartwig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+antigen+uptake+by+lung+DC+contributes+to+allergic+airway+hyper-responsiveness+and+inflammation.">Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).</li><li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dendritic+cell+lineage:+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting.">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annu. Rev. 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L., Sisirak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells:+recent+progress+and+open+questions.">Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).</li><li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo.">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).</li><li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+I+IFN-Flt3+ligand+axis+augments+plasmacytoid+dendritic+cell+development+from+common+lymphoid+progenitors.">A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors.</a> J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).</li><li>Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cell+lines+with+lymphopoietic+activity+express+high+levels+of+a+pre-B+neoplasia-associated+molecule.">Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule.</a> Cell. 48, 1009-1021 (1987).</li><li>Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Flt3+signal+transduction+cascade+rescues+and+enhances+type+I+interferon-producing+and+dendritic+cell+development.">Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development.</a> J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).</li><li>Szilvassy, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+inhibitory+factor+upregulates+cytokine+expression+by+a+murine+stromal+cell+line+enabling+the+maintenance+of+highly+enriched+competitive+repopulating+stem+cells.">Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells.</a> Blood. 87, 4618-4628 (1996).</li><li>Arcanjo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+heparan+sulfate+derived+from+murine+hemopoietic+stromal+cell+lines:+a+bone+marrow-derived+cell+line+S17+and+a+fetal+liver-derived+cell+line+AFT024.">Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024.</a> J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+progenitor+with+prominent+plasmacytoid+dendritic+cell+developmental+potential.">A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential.</a> Immunity. 38, 943-957 (2013).</li><li>Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+B-lymphoid+cultures+from+murine+bone+marrow+establishment+and+cloning+by+using+stromal+cell+line+AC+6.21.">Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21.</a> Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).</li><li>Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Plasmacytoid+Dendritic+Cell+from+Common+Lymphoid+Progenitors+by+Flt3+Ligand.">Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).</li></ol>

ここでは、のCLPの少数から、特にDCの堅牢な世代のためのin vitro培養系を説明し、pDCに。この培養系の独自性は、フィーダーとしてのAC-6細胞、ストローマ細胞株の使用によるものです。このアプローチは、IL-7、SCF、M-CSFおよびFL 20などのサイトカインが、また、DCの発達をサポートするのに必要な細胞-細胞接触21だけでなく、提供することが示されています。 AC-6細胞は?...

樹状細胞（DC）は、1免疫応答の制御に重要な役割を果たしているプロフェッショナル抗原提示細胞です。 DCは不均一であるが、それらは、大きく2つの集団に分類することができ、従来のDC（のCDC）および形質のDC（pDCに）2,3。リンパ器官に加えて、のCDCとのpDCは、肺、腸および皮膚2を含む組織中に見出されます。 CDCとのpDCの形態はのCDCは、デンドライト状の突起と以上のプラズマ細胞様であることのpDCの形状を呈すると、異なります。また、一般的なマウスDCマーカーCD11cのは、より高度のpDC上でのCDCより上で発現されます。 pDCに2が行うよりも、MHCクラスIIの高いレベルと共刺激分子を発現どちらのCD24 +のCDC、 -のCDCとのCD11b -また、のCDCは、さらにのCD11b + CD24に分けることができます。成熟のpDCは、一方で、選択シグレックHおよびBST2 4を発現することが示されています。 Functionally、のCDCは、pDCにはよりも優れた抗原提示細胞です。しかし、pDCには、私は、ウイルス感染または炎症性刺激5時に型インターフェロンの膨大な量を生成することができます。 両方のCDCとのpDCは短命であるため、常に骨髄（BM）6,7内の前駆細胞から補給する必要があります。致死的に照射したマウスに共通の骨髄前駆細胞（のCMP）とリンパ球系共通前駆細胞（のCLP）の養子移入はのCDCとのpDCは、両方の系統8-10から生成することができることを実証しています。しかし、RAG1 / 2を発現し、IgH遺伝子座11,12に再配置DJセグメントを所有するpDCのサブセットがあります。これらの細胞はまた、B220マーカーの発現は、核酸感知受容体（TLR7 / TLR9）、および転写因子（SPIBとBcl11a）13を含む Bリンパ球との分子の類似性を共有すると、すべてがリンパ系列の署名であると考えられています。したがって、CLPsがあるため、系統の類似のpDCのインビトロ生成のための良い選択かもしれません。 ヒトおよびマウスの両方でのCDCとのpDCの頻度が非常に低いが6、DCは、特にたCDCは、（例えば、GM-CSF 11,14またはFlt3リガンドなどのサイトカインの存在下で、BMまたは前駆細胞からインビトロで生成することができるFL ）フィーダーフリーシステム11,15,16を使用 。しかし、残念ながら、それは、FL 11,15,16 を用いてインビトロでのpDCの多くを生成することは不可能です。以前に我々は、pDCには、効率的にAC-6フィーダシステム17を使用してのCLP からインビトロで生成することができることを実証しました。培養系においてAC-6間質細胞株を使用することの利点は、それが細胞 - 細胞接触とのCLPからのpDCの多数の生成をサポートするサイトカインの分泌を提供することです。このシステムの生産は非常に堅牢ですが、下記の手順を慎重にレプリケーションが私を必要とされますn個の順序のpDCの効率的な生成を確実にします。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108408</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108708</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse&#160; CD11b (PE), cloneM1/70</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101208</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115508</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103208</td>
			<td>linage marker/FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100308</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100707</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107608</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116208</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135510</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105824</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108106</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135014</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101206</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS sorting tube&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>Flow analysis sofrware</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of murine plasmacytoid dendritic cells from common lymphoid progenitors using the ac-6 feeder system

形質細胞様樹状細胞（pDC）感染に応答して、または炎症応答の間に活性化された細胞を産生Iインターフェロン強力型（IFN-I）です。残念ながら、pDCの機能の研究は、リンパ器官で、その低周波によって妨げられ、in vitroでのDC生成のための既存の方法は、主にpDCを超えるのCDCの生産を好みます。ここでは、効率的にin vitroでのリンパ球系共通前駆細胞（のCLP）からのpDCを生成するためのユニークなアプローチを提示します。具体的には、プロトコルは、骨髄からのCLPを浄化し、Flt3リガンドの存在下でγ線を照射し、AC-6フィーダー細胞との共培養により、pDCにを生成する方法の詳細を説明しました。この培養系のユニークな特徴は、のCLPは、AC-6細胞の下に移動して、石畳の領域形成細胞になることのpDCを拡大するための重要なステップです。形態学的に異なるDCは、すなわちたpDCとのCDCは、7の組成物で約2週間後に生成されました最適な条件の下で0から90パーセントのpDCに。通常、この方法によって生成されたpDCの数はおおよそのCLPの数の100倍がシードされます。したがって、これは、確実に、これらの細胞の発達と機能にさらなる研究を容易にするために必要なのpDCを大量に生成すると、新規システムです。

4-6x10 7 BM細胞の総数は、典型的には、大腿骨一6~8週齢の野生型C57BL / 6マウスの脛骨から単離されます。 CLPを整理するには、総BM細胞は、系統マーカー（CD3、CD8、B220、CD19、CD11bの、GR-1、Thy1.1、NK1.1、TER119、およびMHC-II）に対するPE結合抗体で染色され、抗-c-Kitの-PerCPを/ Cy5.5を、抗SCA-1-FITC、抗M-CSFR-APCおよび抗IL-7Rα-PE / Cy7の、分析し、セルソーターでソート。 CLPのための選別戦略は<stron...

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In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System (Video) | JoVE

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

AC-6フィーダシステムを使用してリンパ球系共通前駆細胞からマウス形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成に

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

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追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

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マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

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黒色腫と扁平上癌幹細胞を用いた新規樹状細胞ワクチンの生成

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System (Video) | JoVE

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors (Video) | JoVE

造血前駆細胞の養子移入を使用して、パイエル板におけるマウス形質細胞様樹状細胞の開発を評価

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System. (Video) | JoVE

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes (Video) | JoVE

代謝表現型が異なる未熟、熟女と寛容原性樹状細胞の生成

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow (Video) | JoVE

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood (Video) | JoVE

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro (Video) | JoVE

生体外でマウスのナチュラル キラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...