Name: using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements
Uploaded: 2015-10-30T14:00:00
Duration: 10 min 39 s
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The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

注：1が赤骨格筋からのミトコンドリアを隔離した後にこのプロトコルを開始します。赤色骨格筋13 100mgの-以前〜75で説明したようにミトコンドリアを単離しました。 （Frisard ら 13を参照してください）2（IBM）は、ミトコンドリアのタンパク質を10μg/μlではミトコンドリアのための分離バッファの≤50μlの最終的なミトコンドリアのペレットを再懸濁することにより、組織のこの量から達成されるであろう- 5の間。 1.セットアップ<ol><li>その後のアッセイのためのワーキングストック溶液（ 表1）およびミトコンドリアアッセイ溶液（MAS）ミックス（ 表2）を準備します。 注：最もストック溶液およびMASを格納できるようなアッセイのための調製物の大部分は、事前に行うことができます。 </li><li> 37℃での非CO 2インキュベーター内で実験前の夜1ミリリットルの較正溶液中の呼吸アッセイカートリッジを水和。 </li><li>実験の日、トンAKEアウト凍結ストック（基材とミトコンドリアのモジュレーター、MASミックス、MAS W / O BSA、 表1）および37℃のバスまたはインキュベーターで解凍。 </li><li>すべての基質溶液（ 表3）、注射（ 表4-5）を準備し、（pH7.4）に、必要に応じてpHを調整します。 pHを調整した後、氷上で保存します。 </li><li>プログラムの適切なミックス、待って、測定パラメータにマルチウェルの酸素消費量測定装置は、最初に「標準」モードに続く解析ソフトウェアを、次のように入力して、ラベルの背景とグループ/条件のウェル（ 表6を参照してください）。 <ol><li> 「ゲスト」フォーラムに入力し、「アッセイウィザード」をクリックしてください。かつて「アッセイウィザード」で、ミックスを変更する待機し、パラメータを測定する「プロトコル」をクリックしてください。 「バックの下にバックグラウンドウェルにラベルを付けます。補正」タブをハイライト表示するようにしてください &quot;&quot;バックグラウンド補正を行います。 </li><li>ラベルCOND「グループ情報」タブに続いて「グループとラベル」タブ、上の最初のクリックしてitions。これらのパラメーターが入力された後、「テンプレート保存」に続いて、「終了」をクリックします。 </li></ol></li></ol> 2.ザ・アッセイを実行します<ol><li>アッセイの実行カートリッジに注入溶液をロードし、最初の「標準」モードに入るに続く解析ソフトウェアを、入力してキャリブレーションを開始します。 「ゲスト」フォーラムに入ります。 「テンプレート」タブで、「XF」ドライブの下にステップ1.5で保存したテンプレートを開きます。オープンしたら、キャリブレーションを開始するには、「スタート」をクリックします。 注：分析の実行カートリッジは、左下に切り欠きの角を持つマシンに入力する必要があります。これは、約30分かかります。適切なポートにソリューションを注入するように注意してください。 表4-5の注射はロードの順に表示されます。 </li><li>静かに、しかし完全にmitochondを混ぜますそっとそのオリフィスはハサミで先端の末尾から〜3ミリメートルを切断することによって広がってきた200μlのピペットチップで株式を粉砕に続いて、200μlのピペットチップで溶液を攪拌することにより、RIAの株式。 </li><li>ミトコンドリアの株式のタンパク質濃度を決定するために、ビシンコニン酸（BCA）アッセイを実行します。 </li><li>ステップ2.3から取得した株式の濃度を使用して、コハク酸/ロテノン基質ミックス（ 表3）のミトコンドリアタンパク質/ 200μLの10μgの再懸濁します。ミトコンドリアタンパク質の14μgの/残りの基質ミックス200μlを（ 表3）（ これは、各基質ミックスのために行われなければならない）再懸濁します。すべてのミトコンドリアタンパク質/基質を氷上でミックス置きます。 注：以前9に記載されているように 、各アッセイのために、ウェルあたりのミトコンドリアのタンパク質の最適量を決定しました。それが決定されたそのピルビン酸/リンゴ酸、パルミトイルカルニチン/リンゴ酸、グルタミン酸/リンゴ酸のANコハク酸/ロ​​テノンアッセイはミトコンドリアタンパク質2.5μgのウェルあたりを利用しながら、D電子流アッセイは、ミトコンドリアタンパク質の3.5μgのを利用しています。そのため、研究者は4があるので、このステップで複製するための十分なミトコンドリアタンパク質を再懸濁する必要があるのいずれかを2.5μgまたは50μLあたり3.5μgのはウェル当たりロードされる（ステップ2.6を参照してください）​​。 </li><li>静かに、しかし完全に静かに最後の〜3ミリメートルを持った200μlのピペットチップで株式を粉砕に続いて200μlのピペットチップを用いて溶液を、攪拌することにより、ミトコンドリア/基質溶液を混合を遮断します。 </li><li>氷の上と三重で細胞培養プレートを置き、ミトコンドリア/基質ミックスの各負荷を50μl/ウェル。マイクロプレートベースの呼吸アッセイの開発者は、好ましくは、細胞培養プレート上のいずれかの側に、2ブランク（無ミトコンドリア）をウェルの最小値を残してお勧めします。 </li><li> 4℃で20分間、2,000×gで細胞培養プレートをスピン。プレートがsであるがピン止め、37℃の水浴中で基質溶液を温めます。 </li><li>スピンが完了した後、慎重に各ウェルの上に各基質溶液450μlのをロード（ すなわち 、最初にこの基質溶液中に再懸濁させ、ミトコンドリアを持つウェルにピルビン酸/リンゴ酸基質をロード）。 RTでプレートをロードしてください。注：ブランクウェルは、基板の500μlのロードする必要があります。結合されたアッセイブランクウェルは、任意の結合アッセイ基質をロードすることができる一方で電子流アッセイのために指定されたブランクウェルは、電子流基板（ピルビン酸/リンゴ酸+ FCCP）をロードする必要があります。 注：分析の実行が「音源」タブから「XFリーダー」プラットフォームを使用して完了した後、同じプレート上に結合され、電子の流れのアッセイを行う場合には、研究者がそれぞれのアッセイにバックグラウンドウェルを再割り当てする必要があります。かつて「インストゥルメント」の設定の中に、「管理」をクリックしてください「バックグラウンド補正」に続くタブ、。完了したら、「装置のセットアップモードを終了」ヒット。アスコルビン酸塩/ TMPDの組み合わせは、このように独立したバックグラウンド補正は、各アッセイタイプに必要とされるO 2 を消費することができるからです。 </li><li>基板の450μlの後、各ウェルに添加し、ミトコンドリアが単一の単分子層（20X倍率[ロジャース9、 図4を参照してください ]）の中に均一に分散されることを保証することは、十分にミトコンドリアの層を表示します。均等に分散単層を持っているようには見えないウェルは、 事後除去することができます 。 </li><li>ミトコンドリアの遵守のためにチェックした後、呼吸分析機器にマイクロプレートを挿入し、「OK」をクリックして実行しアッセイを開始します。 注意：実行が開始される前にステップ2.1からのキャリブレーションが完了していなければなりません。研究者は、「OK」をクリックすると、機械は、キャリブレーションのために使用されたユーティリティ・プレートを排出します。 <ol> &lt;LI&gt;ユーティリティプレートを取り外し、トレイ上のミトコンドリアを含む細胞培養プレートを配置します。細胞培養プレート上の青色のノッチは、トレイの左下隅に配置する必要があります。アッセイの実行を開始するには、「継続」、をクリックしてください。 </li></ol></li><li>実行が完了すると、画面上で「取り出し」を押すことによって、細胞培養プレート、カートリッジを取り出します。 <ol><li>プレートが排出されたら、削除して、細胞培養プレートとカートリッジを破棄し、画面上で「続行」をクリックします。ランは自動的に「データ」ファイル内の.xlsファイルとして保存されます。 </li></ol></li><li>このファイルを開いて、「Y1：」の下に下向きの矢印を押すことで「OCR」を「O2」から表示を変更マーカー。 <ol><li>オプション：下の次の変更「中間点」を「ポイント・ツー・ポイント・料金」「速度データとして表示 &quot;。これらの変更を適用するには、「OK」をクリックしてください。 </li></ol&gt; </li><li>一緒に同じような条件のグループウェルに画面の左下に「まあグループモード」タブをクリックします。最後に、左に、画面の中央に向かって、「サンプル平均値/標準エラー」タブをクリックします。アッセイは「アッセイウィザード」の設定で開始される前に別の方法として、これらのコマンドを設定することができます。 注意：各条件は各レートと各条件について表示平均±標準偏差を持つことになります。条件ごとに取得率の測定（4回の注射が続く状態2 [結合] / State3u [電子流れ]呼吸）があります。 、第二の測定の状態2速度の平均値を使用し、注射をオリゴマイシン後最小点での状態40を決定し、ADPとFCCP注入した後の状態3と状態3Uの最大ポイントを使用し、それぞれ、およびアンチマイシンAの最低ポイントを使用カップリングアッセイのために誘導された呼吸。最小値を使用して、ピルビン酸/リンゴ酸誘導状態の3U呼吸のための最大のポイントを使用しますロテノン誘発される呼吸のためのポイント、コハク酸誘導状態の3U呼吸のための最大のポイントを使用し、電子フローアッセイのためのアンチマイシンA誘発された呼吸のための最小点を使用しています。すべての実験は3回行い、示したデータは代表的なトレーシングの結果です。 </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435, 297-312 (2011).</li><li>Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+muscle+mitochondrial+DNA+content,+mitochondrial+enzyme+activity+and+oxidative+capacity+in+man:+alterations+with+disease.">Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease.</a> European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).</li><li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+levels+of+lipopolysaccharide+modulate+mitochondrial+oxygen+consumption+in+skeletal+muscle.">Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle.</a> Metabolism. 64, 416-427 (2015).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathways+and+respiratory+control.">Mitochondrial pathways and respiratory control.</a> , (2007).</li></ol>

ジョージ・W・ロジャーズは、これらのアッセイが開発されたときのための機器を製造してタツノオトシゴバイオサイエンスの従業員です。

マウス骨格筋の100 mgの - この記事で紹介した方法は、75から分離されたミトコンドリアを用いて、マイクロプレートベースの呼吸アッセイのコレクションのパフォーマンスのためのステップバイステップの手順を提供します。これらのアッセイは、三連のウェル間の緊密な標準偏差によって証明されるように高精度に行うことができます。重要なことに、これらのアッセイは、異常呼吸及び/又は適応は、一般的に使用される動物モデルにおいてETC、TCAサイクル、β酸化経路、基板の輸送等に発生することができる場所を特定する可能にします。 これは、このプロトコルで使用されるさまざまな燃料や阻害剤を使用するための理論的根拠を強調することが重要です。ピルビン酸/リンゴ酸およびグルタミン酸/リンゴ酸呼吸アッセイは私が呼吸を媒介、ならびにそれらのそれぞれのトランスポーターの評価、およびグルタミン酸の場合、デアミナーゼ15における複合体の評価を可能にします。代替的に、の組み合わせロテノンは、複合体Iを阻害し、コハク酸は、フラビンアデニンジヌクレオチドの還元により複合体IIに電子を提供するので、コハク酸/ロテノンは（FADH 2）15 ETCの複合体IIを介してミトコンドリア呼吸フラックスの評価を可能にします。これらのアッセイは、結合効率と最大呼吸のような基板の特定の情報を提供します。電子流アッセイは、基質および阻害剤の組み合わせが、ミトコンドリア呼吸フラックス9中に複数の複合体の評価が可能になるという点で独特です。コハク酸続いロテノンの注射は複合体IIによって駆動評価の最大の呼吸を可能にしながら、ピルビン酸/リンゴ酸+ FCCPの初期基質ミックスは、複合体Iで駆動される最大の呼吸の評価を可能にします。アスコルビン酸/ TMPDがあるので、アスコルビン酸/ TMPDの注入に続いてアンチマイシンA、複合体IIIの阻害剤の注入は、複合体IVで駆動される呼吸の評価を可能にチトクロームC /複合体IVへの電子供与体。結合効率についての情報が得られないが、この方法は、独立して複数の基板を実行して排除する非常に小さなサンプルサイズに最適です。最後に、パルミトイルカルニチン/リンゴ酸を使用することは、β酸化およびパルミチン酸（β酸化）フラビンタンパク質15を電子輸送を通じてETCに供給の酸化から生産削減同等以来ETC間の調整の評価が可能になります。これは、カップリングと電子フローアッセイはまた、何らかの介入（薬物治療、遺伝子操作）にミトコンドリア機能の変化を同定するために連携して使用することができることに留意すべきです。 これらのアッセイのために達成し、高精度は、前タンパク質決意に、または基板ソリューションであるかどうかを、主にミトコンドリアの完全な混合に起因するものです。この線に沿って、ミトコンドリア一度基板solutioにresuspendendされますNSは、それが広がったオリフィスピペットチップでステップ2.2で説明したように細胞培養プレートをロードする前に十分、この溶液を混合することが重要です。ミトコンドリアをミックスに失敗すると、徹底的に分析内の大きな変動につながります。また、ミトコンドリアを混合しながら剪断力を作成し、狭いオリフィスピペットチップを使用すると、接着ステップ（2.7）も、このプロトコルにおける重要なステップであるミトコンドリア膜およびシトクロムCの放出を損傷する可能性を増大させます。長い/十分に速くロードされた細胞培養プレートを回転しないと、このように井戸と測定値の間の増加変動をリードし、ウェルにミトコンドリアの不完全密着性になります。 記載されているプロトコルが含まれるように最適化されています：、ウェルあたりのミトコンドリアのタンパク質の最適量をロードする株式及び基板ソリューションを作るために正しい濃度/調製法を用いて、ミトコンドリアの状態ナンプラーを確保するためのアッセイの実行を変更しますteaus、およびミトコンドリア株式およびミトコンドリア/基質混合物の適切な混合。これらの最適化の取り組みに先立ち、著者らは、アッセイの実行に落とし穴が発生しました。以下は、このプロトコルを最適化するのに便利でしたトラブルシューティング方法/修正について説明します。マイクロチャンバー内の酸素を排出し、不正確な測定につながるあまりミトコンドリアのロード中に、最適な負荷に関して、負荷が少なすぎるミトコンドリアは、強固な応答を誘発しません。ロジャースら 9は、マイクロプレートベースの呼吸アッセイのために、ウェルあたりのミトコンドリアの最適な積載量を決定する例を示します。多くの場合、あまりにも多くのミトコンドリアはロードごとにだけでなく、100〜200ピコモル/分/ウェルと状態3速度オーバー状態2速度/ウェル&gt; 1500ピコモル/分によって証明されます。 （。 - 10μgの例えば 、1の間）は、動的R内のOCRを引き出すためにオーバーロードが発生した場合は、ミトコンドリアタンパク質の濃度を変化させて実験を行います酸素消費量測定装置のアンジュ。準備と基板との株式の正確な濃度を使用することは最も重要です。常に基板/注射の酸形態を使用し、水酸化カリウムまたは塩酸を用いてpHを調整します。ナトリウムバッファ/ソリューションが推奨されていません。また、DMSO中の基質/株式または100％エタノールを再懸濁して、測定の障害やエラーになります。指摘の95％エタノールを使用してください。パルミトイルカルニチンは、このように大きな変動を引き起こし、凍結ストックを解凍した後、95％エタノールから沈殿することが一般的です。使用する前によくパルミトイルカルニチンストックと渦をウォームアップしてください。また、非常に可変ピルビン酸/リンゴ酸分析結果が原因ピルビン酸在庫が&gt; 2週齢であることとすることができます。 2週間ごとにピルビン酸の凍結アリコートをリメイクしてください。アッセイの実行は、ミトコンドリアの状態のプラトーを確保するために2分間の測定に変更されました。 ADPの枯渇の観察が必要な場合は、研究者はよいです「アッセイウィザード」フォーラムの下で「プロトコル」タブの下に測定時間を延長します。ミトコンドリアの株式やミトコンドリアプラス基板ソリューションが完全にロードする前に均質化されていない場合最後に、大きな変動が発生します。ウェル間の変動は、アッセイの実行後に高い場合は、完全に先立って次の実験に基質溶液を混合してください。決してミトコンドリア/基質溶液をボルテックスしない、むしろ、マッシュを攪拌し、ゆっくりと広げオリフィスピペットチップで粉砕します。 注目に値するこの技術のいくつかの制限があります。最初に、これらのアッセイのために使用される細胞培養プレート上のウェルの数が比較的低い（ すなわち 、24ウェルおよびブランクウェルのために指定される少なくとも2）。それは、1つのプレート上にこれらのアッセイのすべて5を実行することが望まれる場合、研究者は、一度に1つのマウスからの応答を調べることができます。しかし、96ウェル機器がhigheために利用可能であることに留意すべきですR・スループット。第二に、1無傷の細胞中に比べて単離ミトコンドリアにおけるミトコンドリア機能障害の評価に固有の長所と短所があります。いくつかの弱点は、無傷の細胞と分離プロセスから誘導成果物に比べて少なく、生理学的関連性を有するものが挙げられます。最後に、この方法の成功は、ミトコンドリアの単離プロセスの品質次第です。 これらのアッセイのいくつかは、どちらかの異なるシステムが開発されているまたは他の動物モデルで確認されているが、本明細書に提示される方法は、マルチウェル酸素消費量測定装置を用いてマウスに最適な使用のための上記のアッセイの全てを合成する最初のものです骨格筋。したがって、最小限の材料で高いスループットを提供し、マウス骨格筋100mgの - 重要なことに、これらのアッセイの全ては、5〜75から単離されたミトコンドリアの量を行うことができます。大きな意義、マルチウェルの能力の酸素消費技術が最適化された分離方法と組み合わせて、ミトコンドリアの最小量とのアッセイを実行するために、研究者は、骨格筋組織の残りは他の実験（ 例えば 、ウェスタンブロットの多数を実行することができ、RT-PCR、酵素アッセイ、など）、多くの場合、この動物モデルとの闘いです。 結論として、本明細書に提示する方法は、マウス骨格筋の最小量を用いて、マイクロプレートベースの呼吸アッセイのコレクションのパフォーマンスのためのステップバイステップの手順を提供します。重要なことは、提示された方法は、組織およびミトコンドリアの最小量を必要とします。一度習得し、本明細書に記載の技術は、研究者が一般的に使用される動物モデルにおいてミトコンドリアの酸素消費量に対する化合物または遺伝子産物の潜在的なメカニズムを決定することを可能にします。

骨格筋のミトコンドリアの主な生理学的役割は、酸化的リン酸化1からATPを生成することです。重要なのは、骨格筋のミトコンドリアは3、変性疾患4及びII型糖尿病5老化 、運動能力2に特異的な役割を果たしています。高齢化社会、およびII型糖尿病、米国6における死亡の7 番目の主要な原因であるとして、ミトコンドリアの機能を評価する方法の必要性は、生物医学研究7,8でますます普及しています。それは酸化的リン酸化9の機能構成要素を表現するために、ミトコンドリアおよび核ゲノム間の協調機能を表しているので具体的には、酸素消費量の測定は、ミトコンドリア機能の評価に非常に優れた有用性を有します。 いくつかの技術は、それが無傷の細胞に酸素消費量の測定を可能にし、単離存在しますDミトコンドリア7-10。さらに、アッセイは、複数の細胞型や組織のために開発され、ミトコンドリア経路および呼吸制御9,11,12の測定を可能とする様々な種にされています。しかし、マイクロプレートベースの酸素消費技術で使用するために、マウスの骨格筋から単離したミトコンドリアを用いて、これらのアッセイのすべてのコンパイルに関しては文献でvoid現在があります。重要なことは、マイクロプレートベースの呼吸アッセイの使用は、ミトコンドリアの生物学者の間で成長しており、単離ミトコンドリア9の最小量を用いて、高スループットの測定を可能にしています。したがって、マイクロプレートベースの呼吸アッセイのコレクションは、異常および/または適応が電子伝達鎖（ETC）で発生することができる場所の特定することができ、その開発されました。さらに、2つの付加的なマイクロプレートベースのアッセイは、呼吸協調betweeの評価を可能に開発されましたトリカルボン酸（TCA）回路やETC、およびSS-酸化との間などのn重要なことは、提示される方法は、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア機能のメカニズムの変化を測定するための明確で簡潔な方法を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63559</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essentially Fatty&#160;</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A6003</td>
			<td rowspan="2">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Free- BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &#8805;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Glutamic acid</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">G1251</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">T7394</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99%, powder [TMPD]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A, &#8805; 95% (HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td>
			<td rowspan="3">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="3">C2920</td>
			<td rowspan="3">Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylhydrazone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8805;98% (TLC), powder [FCCP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A5285</td>
			<td rowspan="2">Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

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Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

発生生物学

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from various somatic cell types by transducing four Yamanaka transcription factors: Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. The study of iPSCs remains at the cutting edge of biological and clinical research. In particular, patient-specific iPSCs can be used as a pioneering tool for the study of disease pathobiology, since iPSCs can be induced from the tissue of any individual. Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease, classified by the destruction of cartilage and bone structure in the joint. Synovial hyperplasia is one of the major reasons or symptoms that lead to these results in RA. Fibroblast-like Synoviocytes (FLSs) are the main component cells in the hyperplastic synovium. FLSs in the joint limitlessly proliferate, eventually invading the adjacent cartilage and bone. Currently, the hyperplastic synovium can be removed only by a surgical procedure. The removed synovium is used for RA research as a material that reflects the inflammatory condition of the joint. As a major player in the pathogenesis of RA, FLSs can be used as a material to generate and investigate the iPSCs of RA patients. In this study, we used the FLSs of a RA patient to generate iPSCs. Using a lentiviral system, we discovered that FLSs can generate RA patient-specific iPSC. The iPSCs generated from FLSs can be further used as a tool to study the pathophysiology of RA in the future.

Here we describe a protocol for generating human induced-pluripotent stem cells from patient-derived fibroblast-like synoviocytes, using a lentiviral system without feeder cells.

関節リウマチ患者の関節から分離された線維芽細胞様滑膜細胞を用いて誘導多能性幹細胞の生成

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

筋肉疾患の構造的基礎を研究するためのツールとしての無傷のマウス骨格筋のX線回折

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.