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North Billerica, MA

SeaHorse Biosciences

Seahorse Bioscience

Agilent Technologies

eIF4A &#x957F;&#x671F;&#x88AB;&#x4E3A;&#x6B7B;&#x6846; helicases &#x8BA4;&#x4E3A;&quot;&#x9EC4;&#x91D1;&#x6807;&#x51C6;&quot;&#x3002;&#x5728;&#x5F88;&#x5927;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x4E0A;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x53CD;&#x6620;&#x4E86;&#x4E24;&#x4E2A;&#x9879;&#x76EE;&#xFF1A; &#x7B2C;&#x4E00;&#xFF0C;&#x5728;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5408;&#x6210;&#x542F;&#x52A8; eIF4A &#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x662F;&#x6BD4;&#x8F83;&#x597D;&#x5730;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E8C;&#xFF0C;&#x5404;&#x79CD;&#x5404;&#x6837;&#x7684;&#x751F;&#x5316;&#x7814;&#x7A76;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x4E86; eIF4A &#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#xFF0C;&#x8981;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E; ATP &#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#xFF0C;&#x4E09;&#x78F7;&#x9178;&#x817A;&#x82F7;&#x6C34;&#x89E3; RNA &#x4F9D;&#x8D56;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5C55;&#x5F00; RNA &#x53CC;&#x5DE5;&#x4EE5; ATP &#x4F9D;&#x8D56;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x6838;&#x9178;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x6587;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x57FA;&#x672C;&#x7684;&#x610F;&#x89C1;&#x4E3A;&#x751F;&#x5316;&#x4E00;&#x81F4;&#x6027;&#x5BA1;&#x67E5;&#x548C;&#x6839;&#x636E;&#x6B7B;&#x6846;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x53EF;&#x7528;&#x6676;&#x4F53;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E5F;&#x89E3;&#x91CA;&#x3002;&#x88AB;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x975E;&#x845B;&#x4E0E;&#x845B;&#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5408;&#x6210;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#x5BA1;&#x67E5;&#x4E86;&#x662F;&#x8F85;&#x52A9;&#x86CB;&#x767D;&#x56E0;&#x5B50; &#xFF08;eIF4B&#x3001; eIF4G &#x548C; eIF4H&#xFF09; &#x5BF9;&#x8FD9;&#x4E00;&#x6D3B;&#x52A8;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x529B;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&quot;&#x771F;&#x6B63;&quot;&#x7684;&#x89D2;&#x8272;&#x4E3A; eIF4A &#x89E3;&#x65CB;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x5408;&#x6210;&#x662F;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x548C;&#x6709;&#x5173;&#x7684;&#x5176;&#x4ED6;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x53EF;&#x80FD;&#x8FD8;&#x6D89;&#x53CA;&#x975E;&#x845B;&#x4F7F;&#x7528;&#x6216;&#x7565;&#x845B;&#x6B7B;&#x4EBA;&#x7BB1; helicases (&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x5408;&#x6210; RNA &#x62FC;&#x63A5;&#xFF09;&#x3002;

eIF4A&#xFF1A; &#x6B7B;&#x6846; helicases &#x7684;&#x6559;&#x7236;&#x3002;

eIF4A has long been considered the "gold standard" for DEAD box helicases. In large measure, this reflected two items: first, the role of eIF4A in protein synthesis initiation was relatively well established. Second, a wide variety of biochemical studies had established the ability of eIF4A to bind nucleic acids in an ATP-dependent manner, to hydrolyze ATP in an RNA-dependent manner, and to unwind RNA duplexes in an ATP-dependent manner. In this article, these basic observations are reviewed for biochemical consistency and also interpreted in light of the available crystal structures for DEAD box proteins. The role of non-processive vs. processive helicase activity in protein synthesis is discussed. Also examined is the influence of ancillary protein factors (eIF4B, eIF4G, and eIF4H) on this activity. Finally, the "real" role(s) for eIF4A helicase activity in protein synthesis is discussed and related to other circumstances that likely also involve the use of non-processive or slightly processive DEAD box helicases (ribosome biosynthesis, RNA splicing).

eIF4A: the godfather of the DEAD box helicases.

eIF4A a longtemps &eacute;t&eacute; consid&eacute;r&eacute; comme le &laquo; gold standard &raquo; pour les h&eacute;licases DEAD zone. Dans une large mesure, cela refl&egrave;te deux &eacute;l&eacute;ments : Premi&egrave;rement, le r&ocirc;le d&#39;eIF4A dans l&#39;initiation de la synth&egrave;se prot&eacute;ique a &eacute;t&eacute; relativement bien &eacute;tabli. Deuxi&egrave;mement, une grande vari&eacute;t&eacute; d&#39;&eacute;tudes biochimiques avait &eacute;tabli la capacit&eacute; d&#39;eIF4A de lier les acides nucl&eacute;iques de fa&ccedil;on d&eacute;pendante de l&#39;ATP, &agrave; hydrolyser l&#39;ATP de mani&egrave;re ARN-d&eacute;pendante et pour se d&eacute;tendre duplex RNA d&#39;une mani&egrave;re d&eacute;pendante de l&#39;ATP. Dans cet article, ces observations de base sont examin&eacute;es par souci de coh&eacute;rence biochimique et &eacute;galement interpr&eacute;t&eacute;es &agrave; la lumi&egrave;re des structures cristallines disponibles pour les prot&eacute;ines de la zone morte. On discute du r&ocirc;le de non-processive vs activit&eacute; h&eacute;licase processive dans la synth&egrave;se des prot&eacute;ines. &Eacute;galement examiner, c&#39;est l&#39;influence des facteurs de prot&eacute;ines auxiliaires (eIF4B, eIF4G et eIF4H) sur cette activit&eacute;. Enfin, le &laquo; vrai &raquo; r&ocirc;le (s) d&#39;activit&eacute; h&eacute;licase eIF4A dans la synth&egrave;se des prot&eacute;ines est discut&eacute;e et associ&eacute;e &agrave; d&#39;autres circonstances que probables aussi implique l&#39;utilisation de non-processive ou l&eacute;g&egrave;rement processive DEAD zone h&eacute;licases (la biosynth&egrave;se des ribosomes, &eacute;pissage de l&#39;ARN).

eIF4A : le parrain de la zone morte h&eacute;licases.

eIF4A: The Godfather of the Dead Box Helikasen.

eIF4A &egrave; stato a lungo considerato il &quot;gold standard&quot; per elicasi DEAD box. In larga misura, questo riflette due elementi: in primo luogo, il ruolo di eIF4A nell&#39;iniziazione di sintesi della proteina era relativamente ben consolidato. In secondo luogo, una vasta gamma di studi biochimici aveva stabilito la capacit&agrave; di legare gli acidi nucleici in modo ATP-dipendente, di idrolizzare ATP in maniera RNA-dipendente e per rilassarsi duplex RNA in modo ATP-dipendente eIF4A. In questo articolo, queste osservazioni fondamentali sono rivisti per coerenza biochimica e interpretate anche alla luce le strutture di cristallo disponibile per le proteine casella morti. Viene discusso il ruolo di processive vs attivit&agrave; di helicase processive nella sintesi proteica. Ha anche esaminato &egrave; l&#39;influenza di fattori ausiliari della proteina (eIF4B, eIF4G ed eIF4H) su questa attivit&agrave;. Infine, i ruoli &quot;reali&quot; per attivit&agrave; di helicase eIF4A nella sintesi proteica &egrave; discussa e correlati ad altre circostanze che probabilmente anche implicano l&#39;uso di non-processive o leggermente processive morti casella elicasi (biosintesi del ribosoma, RNA splicing).

eIF4A: il padrino dell&#39;elicasi DEAD box.

eIF4A &#x9577;&#x3044;&#x6B7B;&#x3093;&#x3067;&#x30DC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9; &#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x300C;&#x30B4;&#x30FC;&#x30EB;&#x30C9; &#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30C0;&#x30FC;&#x30C9;&#x300D;&#x3092;&#x8003;&#x3048;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5927;&#x898F;&#x6A21;&#x306A;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E; 2 &#x3064;&#x306E;&#x9805;&#x76EE;&#x3092;&#x53CD;&#x6620;&#xFF1A; &#x307E;&#x305A;&#x3001;eIF4A &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5408;&#x6210;&#x958B;&#x59CB;&#x3067;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x306F;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x3088;&#x304F;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x306B;&#x3001;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76;&#x306F; ATP &#x4F9D;&#x5B58;&#x7684;&#x306B;&#x3001;RNA &#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x305F;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x306F;&#x3001;ATP &#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x304A;&#x3088;&#x3073; RNA &#x4E8C;&#x91CD;&#x9396;&#x306F; ATP &#x4F9D;&#x5B58;&#x7684;&#x306B;&#x30A2;&#x30F3;&#x30EF;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3059;&#x308B;&#x6838;&#x9178;&#x3092;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3059;&#x308B;&#x6A5F;&#x80FD; eIF4A &#x306E;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x8A18;&#x4E8B;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x57FA;&#x672C;&#x7684;&#x306A;&#x89B3;&#x6E2C;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x4E00;&#x8CAB;&#x6027;&#x3092;&#x4FDD;&#x3064;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x306E;&#x30EC;&#x30D3;&#x30E5;&#x30FC;&#x3057;&#x3001;&#x3082;&#x6B7B;&#x3093;&#x3060;&#x30DC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5229;&#x7528;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x7167;&#x3089;&#x3057;&#x3066;&#x89E3;&#x91C8;&#x3002;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30C3;&#x30B7;&#x30D6; &#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30C3;&#x30B7;&#x30D6; &#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x5BFE;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x691C;&#x67FB;&#x3053;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x306E;&#x88DC;&#x52A9;&#x7684;&#x306A;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x56E0;&#x5B50; (eIF4B&#x3001;eIF4G&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073; eIF4H) &#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;eIF4A &#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5408;&#x6210;&#x3067;&#x306E;&#x8B70;&#x8AD6;&#x3057;&#x3001;&#x95A2;&#x9023;&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;&#x4E8B;&#x60C5;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x300C;&#x672C;&#x7269;&#x300D;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x975E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30C3;&#x30B7;&#x30D6;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x3092;&#x4F34;&#x3046;&#x304B;&#x82E5;&#x5E72;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30C3;&#x30B7;&#x30D6;&#x6B7B;&#x8005;&#x30DC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9; &#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC; (&#x30EA;&#x30DC;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x751F;&#x5408;&#x6210; RNA &#x30B9;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;)&#x3002;

eIF4A: &#x30C7;&#x30C3;&#x30C9; &#x30DC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9; &#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x30B4;&#x30C3;&#x30C9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B6;&#x30FC;&#x3002;

eIF4A &#xAE34; &#xACE0;&#xB824; &#xD558;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4; &quot;&#xAE08; &#xD45C;&#xC900;&quot; &#xC8FD;&#xC740; &#xC0C1;&#xC790; helicases&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C;. &#xB300;&#xD615; &#xCE21;&#xC815;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294;&#xC774; &#xB450; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; &#xBC18;&#xC601;: &#xCCAB;&#xC9F8;, &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD569;&#xC131; &#xAC1C;&#xC2DC;&#xC5D0; Eif4a&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC740; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC798; &#xC124;&#xB9BD;. &#xB458;&#xC9F8;, &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC0DD; &#xD654; &#xD559;&#xC801; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; &#xD575; &#xC0B0; RNA&#xC5D0; &#xC885;&#xC18D;&#xC801;&#xC778; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; ATP hydrolyze&#xC640; ATP&#xC5D0; &#xC885;&#xC18D;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; RNA duplexes&#xC758; &#xAE34;&#xC7A5;&#xC744; &#xD480;&#xACE0;&#xB294; ATP&#xC5D0; &#xC885;&#xC18D;&#xC801;&#xC778; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; Eif4a&#xC758; &#xB2A5;&#xB825;&#xC744; &#xC124;&#xB9BD; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBB38;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xAE30;&#xBCF8;&#xC801;&#xC778; &#xAD00;&#xCC30;&#xC744; &#xC0DD; &#xD654; &#xD655; &#xC801;&#xC778; &#xC77C;&#xAD00;&#xC131;&#xC744; &#xC704;&#xD574; &#xAC80;&#xD1A0; &#xD558; &#xACE0; &#xB610;&#xD55C; &#xC8FD;&#xC740; &#xC0C1;&#xC790; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xD06C;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xD0C8; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0; &#xBE44;&#xCD94;&#xC5B4; &#xD574;&#xC11D;. &#xBE44; processive processive helicase &#xD65C;&#xB3D9;&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300;&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C; &#xC2DC;&#xD5D8;&#xC774; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC5D0; &#xBCF4;&#xC870; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC694;&#xC18C; (eIF4B, eIF4G, &#xBC0F; eIF4H)&#xC758; &#xC601;&#xD5A5;&#xC774; &#xC774;&#xB2E4;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, &quot;&#xC9C4;&#xC9DC;&quot; &#xC5ED;&#xD560; eIF4A helicase &#xD65C;&#xB3D9;&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB17C;&#xC758; &#xD558; &#xACE0; &#xADF8; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xB2E4;&#xB978; &#xC0C1;&#xD669;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C;&#xB3C4;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; processive &#xB610;&#xB294; &#xC57D;&#xAC04; processive &#xC8FD;&#xC740; &#xC0C1;&#xC790; helicases (&#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xC0DD; &#xD569;&#xC131;, RNA &#xC811;&#xD569;).

eIF4A: &#xC8FD;&#xC740; &#xC0C1;&#xC790; helicases&#xC758; &#xB300; &#xBD80;.

eIF4A durante mucho tiempo ha sido considerado el &quot;gold standard&quot; para helicasas de caja muertos. En gran medida, esto refleja dos elementos: en primer lugar, el papel de eIF4A en iniciaci&oacute;n de s&iacute;ntesis de prote&iacute;na fue relativamente bien establecido. En segundo lugar, una amplia variedad de estudios bioqu&iacute;micos hab&iacute;a establecido la capacidad de eIF4A de &aacute;cidos nucleicos se unen de una manera dependiente de ATP, para hidrolizar ATP en una forma dependiente de RNA y para relajarse d&uacute;plex RNA de una manera dependiente de ATP. En este art&iacute;culo, estas observaciones b&aacute;sicas son revisadas para garantizar consistencia bioqu&iacute;mico y tambi&eacute;n interpretadas a la luz de las estructuras de cristal disponibles para las prote&iacute;nas de caja muertos. Se discute el papel de no-procesual vs actividad helicasa procesual en la s&iacute;ntesis de prote&iacute;nas. Tambi&eacute;n es la influencia de factores auxiliares de la prote&iacute;na (eIF4B, eIF4G y eIF4H) en esta actividad. Finalmente, los roles &quot;reales&quot; para la actividad helicasa de eIF4A en la s&iacute;ntesis de prote&iacute;nas es discutida y se relaciona con otras circunstancias que probablemente tambi&eacute;n implican el uso de no-procesual o ligeramente procesual muertos caja helicasas (bios&iacute;ntesis de ribosomas, RNA empalme).

eIF4A: el padrino de las helicasas de caja muertos.

&beta;-Secretase [&#x4E5F;&#x79F0;&#x4E3A; beta &#x7AD9;&#x70B9;&#x6DC0;&#x7C89;&#x6837;&#x524D;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x88C2;&#x89E3;&#x9176; 1 (BACE1&#xFF09;] &#x662F;&#x4E00;&#x79CD;&#x9176;&#x53C2;&#x4E0E;&#x963F;&#x5C14;&#x8328;&#x6D77;&#x9ED8;&#x75C5;&#x60A3;&#x8005;&#x7684;&#x5927;&#x8111;&#x4E2D;&#x7684; &beta;-&#x6DC0;&#x7C89;&#x6837;&#x6591;&#x5757;&#x7684;&#x751F;&#x4EA7;&#x7684;&#x3002;&#x589E;&#x5F3A;&#x7684;&#x751F;&#x4EA7;&#x7684;&#x8FD9;&#x79CD;&#x9176;&#x53D1;&#x751F;&#x65E0; BACE1 &#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x76F8;&#x5E94;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;&#x590D;&#x6742;&#xFF09; 5&#39; &#x9886;&#x8896; BACE1 &#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x5305;&#x542B;&#x4E09;&#x4E2A;&#x4E0A;&#x6E38; ORFs (uORFs) &#x524D; BACE1 &#x542F;&#x52A8;&#x5BC6;&#x7801;&#x5B50;&#x3002;&#x5728;&#x6B64;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8C03;&#x67E5;&#x4E86;&#x8FD9; 5&#39; &#x9886;&#x8896;&#x5982;&#x4F55;&#x5F71;&#x54CD;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x6548;&#x7387;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x7406;&#x89E3;&#x589E;&#x5F3A;&#x7684;&#x751F;&#x4EA7;&#x7684;&#x8FD9;&#x79CD;&#x9176;&#x5728;&#x75BE;&#x75C5;&#x7684;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B65;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x8F6C;&#x67D3;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x7EC6;&#x80DE;&#x682A;&#x548C;&#x65E0;&#x7EC6;&#x80DE;&#x88C2;&#x89E3;&#x8BB0;&#x8005;&#x6784;&#x9020;&#xFF0C;&#x8868;&#x660E;&#x4ECB;&#x5BFC; BACE1 5&#39; &#x9886;&#x8896;&#x7684;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x662F;&#x7AE0;&#x4F9D;&#x8D56;&#x548C;&#x6291;&#x5236;&#x7531; 5&#39; &#x9886;&#x8896;&#x5185;&#x6240;&#x8F7D;&#x7684;&#x987A;&#x5F0F;&#x6BB5;&#x3002;UORFs &#x4E2D;&#x65AD;&#x4E86;&#x5BF9;&#x7FFB;&#x8BD1; B104 &#x7EC6;&#x80DE;&#x6CA1;&#x6709;&#x5F71;&#x54CD;&#x8FD9;&#x662F;&#x4EE4;&#x4EBA;&#x60CA;&#x8BB6;&#x7684;&#x56E0;&#x4E3A;&#x524D;&#x4E24;&#x4E2A; AUGs &#x9A7B;&#x7559;&#x5728;&#x4E0A;&#x4E0B;&#x6587;&#x80FD;&#x591F;&#x542F;&#x52A8;&#x5BC6;&#x7801;&#x5B50;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x53EF;&#x80FD;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#xFF0C;&#x6765;&#x89E3;&#x91CA;&#x5982;&#x4F55;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x7ED5;&#x8FC7; uORFs&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x91CD;&#x65B0;&#x5F00;&#x5C55;&#x3001; &#x6F0F;&#x626B;&#x63CF;&#x548C;&#x5185;&#x90E8;&#x53D1;&#x8D77;&#x7684;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x88AB;&#x53D1;&#x73B0;&#x4E0D;&#x4E00;&#x81F4;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6570;&#x636E;&#x662F;&#x6700;&#x7B26;&#x5408;&#x4ECE; mRNA &#x7684; 5&#39; &#x7AEF;&#x79FB;&#x5230;&#x8D77;&#x59CB;&#x5BC6;&#x7801;&#x5B50;&#x7684;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x6838;&#x7CD6;&#x4F53;&#x5206;&#x6D41; uORF &#x542B; 5&#39; &#x9886;&#x8896;&#x9636;&#x5C42;&#x7684;&#x6A21;&#x578B;&#x3002;&#x5728; PC12 &#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x4E2A;&#x7684; uORF &#x4F3C;&#x4E4E;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63A8;&#x6D4B;&#xFF0C;BACE1 &#x542F;&#x52A8;&#x5BC6;&#x7801;&#x5B50;&#x7684;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x6548;&#x7387;&#x53EF;&#x63D0;&#x9AD8;&#x8C03;&#x8F66;&#x6216;&#x589E;&#x52A0;&#x76F8;&#x5BF9;&#x8F85;&#x52A9; BACE1 &#x542F;&#x52A8;&#x5BC6;&#x7801;&#x5B50;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x673A;&#x5236;&#x589E;&#x52A0;&#x963F;&#x5C14;&#x8328;&#x6D77;&#x9ED8;&#x75C5;&#x60A3;&#x8005;&#x3002;

&#x5229;&#x7528;&#x4E0A;&#x6E38; AUGs beta secretase mrna &#x7684;&#x5DEE;&#x5F02;&#x8868;&#x660E;&#x5206;&#x6D41;&#x673A;&#x5236;&#x89C4;&#x5B9A;&#x4E86;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x3002;

beta-Secretase [also known as the beta-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1 (BACE1)] is an enzyme involved in the production of A beta-amyloid plaques in the brains of patients with Alzheimer's disease. The enhanced production of this enzyme occurs without corresponding changes in BACE1 mRNA levels. The complex 5' leader of BACE1 mRNA contains three upstream ORFs (uORFs) preceding the BACE1 initiation codon. In this study, we investigated how this 5' leader affects translation efficiency as a first step in understanding the enhanced production of the enzyme in the disease. Using reporter constructs in transfected mammalian cell lines and cell-free lysates, we showed that the translation mediated by the BACE1 5' leader is cap-dependent and inhibited by cis-acting segments contained within the 5' leader. Disruption of the uORFs had no effect on translation in B104 cells, which was surprising because the first two AUGs reside in contexts able to function as initiation codons. Possible mechanisms to explain how ribosomes bypass the uORFs, including reinitiation, leaky scanning, and internal initiation of translation were found to be inconsistent with the data. The data are most consistent with a model in which ribosomes shunt uORF-containing segments of the 5' leader as the ribosomes move from the 5' end of the mRNA to the initiation codon. In PC12 cells, however, the second uORF appears to be translated. We hypothesize that the translation efficiency of the BACE1 initiation codon may be increased in patients with Alzheimer's disease by molecular mechanisms that enhance shunting or increase the relative accessibility the BACE1 initiation codon.

Differential utilization of upstream AUGs in the beta-secretase mRNA suggests that a shunting mechanism regulates translation.

b&ecirc;ta-s&eacute;cr&eacute;tase [&eacute;galement connu sous le nom le beta-site pr&eacute;curseur de l&#39;amylo&iuml;de prot&eacute;ine de clivage enzymatique 1 (BACE1)] est une enzyme impliqu&eacute;e dans la production d&#39;un plaques b&ecirc;ta-amylo&iuml;des dans le cerveau de patients atteints de la maladie d&#39;Alzheimer. L&#39;augmentation de la production de cette enzyme se produit sans changements correspondants dans les niveaux d&#39;ARNm de BACE1. Le chef complexe 5&#39; de l&#39;ARNm BACE1 contient trois ORF en amont (uORFs) qui pr&eacute;c&egrave;de le codon d&#39;initiation de BACE1. Dans cette &eacute;tude, nous avons &eacute;tudi&eacute; l&#39;influence de ce leader 5&#39; efficacit&eacute; de la traduction comme une premi&egrave;re &eacute;tape dans la compr&eacute;hension de l&#39;augmentation de la production de l&#39;enzyme dans la maladie. &Agrave; l&#39;aide de constructions de journaliste dans les cellules transfect&eacute;es de mammif&egrave;res et de lysats de cellules libres, nous avons montr&eacute; que la traduction par BACE1 5 leader est d&eacute;pendante de la coiffe et elle est inhib&eacute;e par des segments de cis-actifs contenus dans le leader 5&#39;. Perturbation de l&#39;uORFs n&#39;avait aucun effet sur la conversion en cellules B104, qui a &eacute;t&eacute; surprenant car le deux premiers usine r&eacute;sidence dans des contextes en mesure de fonctionner comme des codons d&#39;initiation. Les m&eacute;canismes possibles pour expliquer comment les ribosomes contournement l&#39;uORFs, r&eacute;installation, analyse qui fuit et interne initiation de la traduction ont &eacute;t&eacute; jug&eacute;es incompatibles avec les donn&eacute;es. Les donn&eacute;es sont plus conformes &agrave; un mod&egrave;le dans lequel les ribosomes shunt uORF contenant des segments de 5 leader que les ribosomes de l&#39;extr&eacute;mit&eacute; 5&#39; de l&#39;ARNm afin le codon d&#39;initiation. Dans les cellules PC12, cependant, le deuxi&egrave;me uORF semble &ecirc;tre traduit. Nous &eacute;mettons l&#39;hypoth&egrave;se que l&#39;efficacit&eacute; de la traduction du codon d&#39;initiation de BACE1 peut &ecirc;tre augment&eacute;e chez les patients atteints de la maladie d&#39;Alzheimer par des m&eacute;canismes mol&eacute;culaires qui renforcent de man&oelig;uvre ou augmentent le codon d&#39;initiation de l&#39;accessibilit&eacute; relative la BACE1.

L&#39;utilisation diff&eacute;rentielle de l&#39;usine en amont dans l&#39;ARNm de la beta-secretase sugg&egrave;re qu&#39;un m&eacute;canisme de man&oelig;uvre r&eacute;glemente la traduction.

Differentielle Nutzung der vorgelagerten AUGs in der Beta-Sekretase-mRNA legt nahe, dass ein Ausschaltungsmechanismus &#xDC;bersetzung regelt.

Beta-secretasi [noto anche come il beta-sito precursore dell&#39;amiloide proteina-fendendo enzima 1 (BACE1)] sono un enzima coinvolto nella produzione di un placche di beta-amiloide nel cervello dei pazienti con malattia di Alzheimer. L&#39;aumento della produzione di questo enzima si verifica senza corrispondenti cambiamenti nei livelli di mRNA di BACE1. Il complesso 5&#39; leader di BACE1 mRNA contiene tre ORFs a Monte (uORFs) precede il codone di avvio BACE1. In questo studio, abbiamo studiato come questo capo 5&#39; influenza l&#39;efficienza di traduzione come un primo passo nella comprensione della produzione dell&#39;enzima nella malattia avanzata. Utilizzando costrutti reporter in linee cellulari di mammifero transfected e lisati cellulari gratis, abbiamo dimostrato che la traduzione mediata dal leader 5 &laquo;BACE1 &egrave; dipendente dal tappo e inibito da cis-acting segmenti contenuti all&#39;interno del capo 5&#39;. Interruzione della uORFs ha avuto alcun effetto sulla traduzione in B104 cellule, che &egrave; stato sorprendente, perch&eacute; le prime due meglio risiede in contesti in grado di funzionare come codoni di iniziazione. Possibili meccanismi per spiegare come i ribosomi bypass uORFs, alimentato, leaky scanning e iniziazione interno di traduzione sono stati trovati per essere coerente con i dati. I dati sono pi&ugrave; coerenti con un modello in cui i ribosomi shunt uORF contenenti segmenti del capo 5&#39; come i ribosomi spostarsi dall&#39;estremit&agrave; 5&#39; del mRNA del codone di avvio. In cellule PC12, tuttavia, la seconda uORF sembra essere tradotto. Si ipotizza che l&#39;efficienza di traduzione del codone di avvio BACE1 pu&ograve; essere aumentato nei pazienti con malattia di Alzheimer di meccanismi molecolari che migliorano la manovra o aumentano il codone di iniziazione relativa accessibilit&agrave; il BACE1.

Utilizzo differenziale di meglio a monte in mRNA della beta-secretasi suggerisce che un meccanismo di manovra regola la traduzione.

&beta;-&#x30BB;&#x30AF;&#x30EC;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC; [&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3082;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30D9;&#x30FC;&#x30BF; &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8; &#x30A2;&#x30DF;&#x30ED;&#x30A4;&#x30C9;&#x524D;&#x99C6;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x5207;&#x65AD;&#x9175;&#x7D20; 1 (BACE1)] &#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30EB;&#x30C4;&#x30CF;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x75C5;&#x60A3;&#x8005;&#x306E;&#x8133;&#x306E; &beta;-&#x30A2;&#x30DF;&#x30ED;&#x30A4;&#x30C9;&#x6591;&#x306E;&#x751F;&#x7523;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x9175;&#x7D20;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x9AD8;&#x3081;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x751F;&#x7523; BACE1 mRNA &#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3067;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x5909;&#x66F4;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;BACE1 mRNA &#x306E;&#x8907;&#x96D1;&#x306A; 5&#39; &#x30EA;&#x30FC;&#x30C0;&#x30FC;&#x306B;&#x306F; BACE1 &#x958B;&#x59CB;&#x30B3;&#x30C9;&#x30F3;&#x306E;&#x524D; 3 &#x4E0A;&#x6D41; Orf (uORFs) &#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;, &#x75BE;&#x60A3;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x9AD8;&#x3081;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x751F;&#x7523;&#x306E;&#x7406;&#x89E3;&#x306E;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B69;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x7FFB;&#x8A33;&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x3053;&#x306E; 5&#39; &#x306E;&#x30EA;&#x30FC;&#x30C0;&#x30FC;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC; &#x30B3;&#x30F3;&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30AF;&#x30C8; transfected &#x54FA;&#x4E73;&#x985E;&#x30BB;&#x30EB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068;&#x7121;&#x6599;&#x306E;&#x30BB;&#x30EB; lysates &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;BACE1 5&#39; &#x6307;&#x5C0E;&#x8005;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x7FFB;&#x8A33;&#x304C;&#x30AD;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3001;5&#39; &#x306E;&#x30EA;&#x30FC;&#x30C0;&#x30FC;&#x5185;&#x306B;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x308B;&#x30B7;&#x30B9;&#x30A8;&#x30EC;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8; &#x30BB;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x3067;&#x6291;&#x5236;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;UORFs &#x306E;&#x4E2D;&#x65AD;&#x52B9;&#x679C; B104 &#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x7FFB;&#x8A33;&#x958B;&#x59CB;&#x30B3;&#x30C9;&#x30F3;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C6;&#x30AD;&#x30B9;&#x30C8;&#x3067;&#x6700;&#x521D;&#x306E; 2 &#x3064;&#x306E; AUGs &#x306B;&#x5B58;&#x5728;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x306F;&#x610F;&#x5916;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x304C;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;UORFs reinitiation&#x3001;&#x6F0F;&#x308C;&#x3084;&#x3059;&#x3044;&#x30B9;&#x30AD;&#x30E3;&#x30F3;, &#x7FFB;&#x8A33;&#x306E;&#x5185;&#x90E8;&#x306E;&#x958B;&#x59CB;&#x306A;&#x3069;&#x3001;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BE;&#x30FC;&#x30E0;&#x3092;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30D1;&#x30B9;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x6A5F;&#x69CB;&#x304C;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3068;&#x4E00;&#x81F4;&#x3059;&#x308B;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x6700;&#x3082;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BE;&#x30FC;&#x30E0; mRNA &#x306E; 5&#39; &#x7AEF;&#x304B;&#x3089;&#x79FB;&#x52D5;&#x3059;&#x308B;&#x958B;&#x59CB;&#x30B3;&#x30C9;&#x30F3;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x30EA;&#x30DC;&#x30BE;&#x30FC;&#x30E0;&#x304C; 5&#39; &#x30EA;&#x30FC;&#x30C0;&#x30FC;&#x306E; uORF &#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30BB;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x3092;&#x30B7;&#x30E3;&#x30F3;&#x30C8; &#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3068;&#x4E00;&#x8CAB;&#x6027;&#x304C;&#x3002;PC12 &#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x7FFB;&#x8A33;&#x3059;&#x308B; 2 &#x756A;&#x76EE;&#x306E; uORF &#x304C;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x4EEE;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x5206;&#x6D41;&#x3092;&#x5F37;&#x5316;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x76F8;&#x5BFE;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30B7;&#x30D3;&#x30EA;&#x30C6;&#x30A3;&#x306F; BACE1 &#x958B;&#x59CB;&#x30B3;&#x30C9;&#x30F3;&#x3092;&#x9AD8;&#x3081;&#x308B;&#x5206;&#x5B50;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30A2;&#x30EB;&#x30C4;&#x30CF;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x75C5;&#x60A3;&#x8005;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B; BACE1 &#x958B;&#x59CB;&#x30B3;&#x30C9;&#x30F3;&#x306E;&#x7FFB;&#x8A33;&#x52B9;&#x7387;&#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x4E0A;&#x6D41;&#x306E; AUGs &#x3067; &beta; &#x30BB;&#x30AF;&#x30EC;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC; mRNA &#x306E;&#x5DEE;&#x52D5;&#x5229;&#x7528;&#x5206;&#x6D41;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x304C;&#x7FFB;&#x8A33;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xBCA0;&#xD0C0;-Secretase [&#xB77C;&#xACE0;&#xB3C4; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xB179;&#xB9D0; &#xCCB4; &#xC804;&#xC870; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC808;&#xB2E8;&#xD615; &#xD6A8;&#xC18C; 1 (BACE1)] &#xC54C; &#xCE20; &#xD558;&#xC774; &#xBA38; &#xBCD1; &#xD658;&#xC790;&#xC758; &#xB1CC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCA0;&#xD0C0;-&#xC544; &#xBC00; &#xB85C;&#xC774;&#xB4DC; &#xD50C; &#xB77C;&#xD06C;&#xC758; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC5D0; &#xAD00;&#xC5EC; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC774; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xC0DD;&#xC0B0; BACE1 mRNA &#xC218;&#xC900;&#xC5D0; &#xD574;&#xB2F9; &#xBCC0;&#xD654; &#xC5C6;&#xC774; &#xBC1C;&#xC0DD;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. BACE1 Mrna&#xC758; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; 5&#39; &#xC9C0;&#xB3C4;&#xC790; BACE1 &#xAC1C;&#xC2DC; codon &#xC55E; &#xC138; &#xC5C5;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB9BC; Orfs&#xB97C; (uORFs)&#xC5D0; &#xD3EC;&#xD568; &#xB418;&#xC5B4; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; 5&#39; &#xC9C0;&#xB3C4;&#xC790;&#xAC00; &#xC9C8;&#xBCD1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xC774;&#xD574;&#xC5D0; &#xC6B0;&#xC120; &#xBC88;&#xC5ED; &#xD6A8;&#xC728;&#xC5D0; &#xBBF8;&#xCE58;&#xB294; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC870;&#xC0AC;. Transfected &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xC138;&#xD3EC; &#xBC0F; &#xC140; &#xBB34;&#xB8CC; lysates &#xAE30;&#xC790; &#xAD6C;&#xBB38;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; BACE1 5&#39; &#xC9C0;&#xB3C4;&#xC790;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC911;&#xC7AC; &#xBC88;&#xC5ED; &#xC774;&#xB2E4; &#xBAA8;&#xC790; &#xC885;&#xC18D; &#xBC0F; cis &#xC5F0;&#xAE30; &#xC138;&#xADF8;&#xBA3C;&#xD2B8; 5&#39; &#xB9AC;&#xB354;&#xC5D0; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC800;&#xD574;. Uorfs&#xC758; &#xC7A5;&#xC560;&#xB294; &#xCC98;&#xC74C; &#xB450; AUGs &#xCEE8;&#xD14D;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xCD08;&#xAE30;&#xD654; codons&#xB85C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xD560; &#xC218;&#xC5D0; &#xC0C1;&#xC8FC; &#xD558;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xB180;&#xB77C;&#xAC8C; &#xD588;&#xB2E4; &#xBC88;&#xC5ED; B104 &#xC140;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xD588;&#xB2E4;. &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; uORFs, reinitiation, &#xC0C8;&#xB294; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC88;&#xC5ED;&#xC758; &#xB0B4;&#xBD80; &#xAC1C;&#xC2DC; &#xB4F1;&#xC744; &#xC6B0;&#xD68C; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD558;&#xB294; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xC640; &#xC77C;&#xCE58; &#xD558;&#xB3C4;&#xB85D; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB410;&#xB2E4;. &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xBAA8;&#xB378;&#xC740; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C; &#xC158;&#xD2B8; 5&#39; &#xC9C0;&#xB3C4;&#xC790;&#xC758; &#xC138;&#xADF8;&#xBA3C;&#xD2B8; Uorf&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xB9AC;&#xBCF4;&#xC19C;&#xC5D0;&#xC11C; Mrna&#xC758; 5&#39; &#xB05D;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC1C;&#xC2DC; codon&#xC73C;&#xB85C; &#xC774;&#xB3D9;&#xB85C;&#xC640; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC77C;&#xCE58; &#xD558;&#xB294;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; PC12 &#xC138;&#xD3EC;,, &#xB450; &#xBC88;&#xC9F8; uORF &#xBC88;&#xC5ED; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0A9;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xBC88;&#xC5ED; &#xD6A8;&#xC728; BACE1 &#xAC1C;&#xC2DC; codon&#xC758; &#xC804;&#xCCA0; &#xAC15;&#xD654; &#xD558;&#xAC70;&#xB098; &#xC0C1;&#xB300; &#xC811;&#xADFC;&#xC131;&#xC740; BACE1 &#xAC1C;&#xC2DC; codon &#xC99D;&#xAC00; &#xD558;&#xB294; &#xBD84;&#xC790; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC54C; &#xCE20; &#xD558;&#xC774; &#xBA38; &#xBCD1; &#xD658;&#xC790;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC99D;&#xAC00; &#xD588;&#xB2E4; &#xAC00;&#xC124;.

&#xBCA0;&#xD0C0;-secretase Mrna&#xC5D0; &#xC5C5;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB9BC; AUGs &#xCC28;&#xB3D9; &#xD65C;&#xC6A9; shunting &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xC870;&#xC808; &#xBC88;&#xC5ED; &#xB098;&#xC654;&#xB2E4;.

beta-secretasa [tambi&eacute;n conocido como el sitio beta precursora del amiloide Hendedoras-prote&iacute;na enzima 1 (BACE1)] es una enzima implicada en la producci&oacute;n de una placas de beta-amiloide en el cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer. La mayor producci&oacute;n de esta enzima se produce sin los cambios correspondientes en los niveles de mRNA BACE1. El complejo de 5&#39; l&iacute;der de BACE1 mRNA contiene tres ORFs aguas arriba (uORFs) precede el cod&oacute;n de iniciaci&oacute;n BACE1. En este estudio, investigamos c&oacute;mo este 5&#39; l&iacute;der afecta la eficiencia de la traducci&oacute;n como un primer paso en la comprensi&oacute;n de la mayor producci&oacute;n de la enzima en la enfermedad. Utilizando construcciones de reportero en l&iacute;neas de c&eacute;lulas de mam&iacute;fero transfected y lisados acelulares, demostramos que la traducci&oacute;n mediada por el BACE1 5&#39; l&iacute;der es dependiente de la tapa e inhibidos por segmentos de cis-actuar dentro de los 5&#39; l&iacute;der. Interrupci&oacute;n de la uORFs no tuvo efecto sobre traducci&oacute;n en c&eacute;lulas B104, que fue sorprendente porque los dos primeros AUGs residen en contextos capaces de funcionar como codones de iniciaci&oacute;n. Los mecanismos posibles para explicar c&oacute;mo los ribosomas puente la uORFs, incluyendo el reinicio, an&aacute;lisis de fugas e iniciaci&oacute;n interna de traducci&oacute;n fueron encontrados para ser inconsistente con los datos. Los datos son m&aacute;s consistentes con un modelo en el cual los ribosomas derivaci&oacute;n segmentos que contienen uORF del 5&#39; l&iacute;der como los ribosomas mover desde el extremo 5&#39; del mRNA al cod&oacute;n de iniciaci&oacute;n. En las c&eacute;lulas PC12, sin embargo, la segunda uORF parece traducirse. Presumimos que la eficiencia de la traducci&oacute;n del cod&oacute;n de iniciaci&oacute;n BACE1 puede incrementarse en pacientes con enfermedad de Alzheimer por mecanismos moleculares que mejoran la derivaci&oacute;n o aumentan el cod&oacute;n de iniciaci&oacute;n de accesibilidad relativa la BACE1.

Utilizaci&oacute;n diferencial de AUGs aguas arriba en el mRNA de la beta-secretasa sugiere que un mecanismo de desv&iacute;o regula la traducci&oacute;n.

&#x6700;&#x8FD1;&#x5F00;&#x53D1;&#x7684;&#x6280;&#x672F;&#x5DF2;&#x542F;&#x7528;&#x591A;&#x4E95;&#x6D4B;&#x91CF;&#x7684; O(2) &#x6D88;&#x8D39;&#xFF0C;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x7814;&#x7A76;&#x7387;&#xFF0C;&#x5C24;&#x5176;&#x662F;&#x836F;&#x7269;&#x548C;&#x8C03;&#x8282;&#x4EE3;&#x8C22;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x673A;&#x7406;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6280;&#x672F;&#x4E4B;&#x95F4;&#x6D77;&#x9A6C; XF24 &#x5206;&#x6790;&#x5668;&#x88AB;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x7528;&#x4E8E;&#x9644;&#x52A0;&#x5728;&#x5355;&#x5C42;&#x5230;&#x591A;&#x4E95;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x57F9;&#x517B;&#x677F;&#x7684;&#x5B8C;&#x6574;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;&#x4EE5;&#x5177;&#x6709;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x65E2;&#x53EF;&#x4EE5;&#x4E25;&#x683C;&#x63A7;&#x5236;&#x80FD;&#x6E90;&#x9700;&#x6C42;&#x548C;&#x886C;&#x5E95;&#x7684;&#x53EF;&#x7528;&#x6027;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F00;&#x53D1;&#x4E86;&#x4E00;&#x9879;&#x8BAE;&#x5B9A;&#x4E66;&#xFF0C;&#x5C55;&#x5F00; XF24 &#x5206;&#x6790;&#x4EEA;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x5206;&#x79BB;&#x7684;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x3002;&#x91C7;&#x96C6;&#x7684;&#x6700;&#x4F18;&#x5229;&#x7387;&#x9700;&#x8981;&#x662F;&#x610F;&#x5916;&#x6709;&#x522B;&#x4E8E;&#x5E38;&#x89C4;&#x7684;&#x6781;&#x8C31;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x6761;&#x4EF6;&#x3002;&#x5728;&#x4F18;&#x5316;&#x7684;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x6765;&#x81EA;&#x79BB;&#x4F53;&#x7684;&#x9F20;&#x809D;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x6240;&#x9644;&#x52A0;&#x5230;&#x7684; XF &#x6D4B;&#x5B9A;&#x677F;&#xFF0C;&#x5E95;&#x90E8;&#x7684;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x5141;&#x8BB8;&#x7387;&#x547C;&#x5438;&#x548C;&#x8D28;&#x5B50;&#x751F;&#x4EA7;&#x591A;&#x4E95;&#x8BC4;&#x4EF7;&#xFF0C;&#x5E76;&#x8981;&#x6C42;&#x6781;&#x5C0F;&#x6570;&#x91CF;&#x7684;&#x6750;&#x6599; (1-10 &#x5FAE;&#x514B;&#x7684;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x6BCF;&#x4E95;)&#x3002;&#x57FA;&#x5E95;&#x7684;&#x8FDE;&#x7EED;&#x6D4B;&#x91CF;&#xFF0C;&#x56FD; 3&#x3001; &#x56FD; 4 &#x548C;&#x5076;&#x8054;&#x523A;&#x6FC0;&#x547C;&#x5438;&#x53EF;&#x901A;&#x8FC7;&#x8BD5;&#x5242;&#x6DFB;&#x52A0;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x4E95;&#x4ECE;&#x6CE8;&#x5C04;&#x7AEF;&#x53E3;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4F7F;&#x7528;&#x9694;&#x79BB;&#x7684;&#x5C0F;&#x9F20;&#x809D;&#x548C;&#x5927;&#x9F20;&#x5FC3;&#x810F;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#xFF0C;&#x6B64;&#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x548C;&#x4F18;&#x5316;&#xFF0C;&#x5E76;&#x8FD0;&#x7528;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x53D1;&#x73B0;&#x78F7;&#x9178;&#x9176;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x5728;&#x5FC3;&#x810F;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x7ED3;&#x679C;&#x7684;&#x590D;&#x6742;&#x4F9D;&#x8D56;&#x7684;&#x547C;&#x5438;&#x7387;&#x5177;&#x4F53;&#x51CF;&#x5C11;&#x7F16;&#x5236;&#xFF0C;&#x5217;&#x5165;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x76F8;&#x4FE1;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B0;&#x6280;&#x672F;&#x5C06;&#x8FDB;&#x884C;&#x836F;&#x7269;&#x7B5B;&#x9009;&#x548C;&#x751F;&#x6210;&#x5C0F;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x6837;&#x672C;&#x4EE5;&#x524D;&#x65E0;&#x6CD5;&#x547C;&#x5438;&#x6570;&#x636E;&#x7279;&#x522B;&#x6709;&#x7528;&#x3002;

&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x5FAE;&#x5B54;&#x677F;&#x4F7F;&#x7528;&#x6700;&#x5C11;&#x6570;&#x91CF;&#x7684;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x547C;&#x5438;&#x6D4B;&#x91CF;&#x3002;

Recently developed technologies have enabled multi-well measurement of O(2) consumption, facilitating the rate of mitochondrial research, particularly regarding the mechanism of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Among these technologies, the Seahorse XF24 Analyzer was designed for use with intact cells attached in a monolayer to a multi-well tissue culture plate. In order to have a high throughput assay system in which both energy demand and substrate availability can be tightly controlled, we have developed a protocol to expand the application of the XF24 Analyzer to include isolated mitochondria. Acquisition of optimal rates requires assay conditions that are unexpectedly distinct from those of conventional polarography. The optimized conditions, derived from experiments with isolated mouse liver mitochondria, allow multi-well assessment of rates of respiration and proton production by mitochondria attached to the bottom of the XF assay plate, and require extremely small quantities of material (1-10 Âµg of mitochondrial protein per well). Sequential measurement of basal, State 3, State 4, and uncoupler-stimulated respiration can be made in each well through additions of reagents from the injection ports. We describe optimization and validation of this technique using isolated mouse liver and rat heart mitochondria, and apply the approach to discover that inclusion of phosphatase inhibitors in the preparation of the heart mitochondria results in a specific decrease in rates of Complex I-dependent respiration. We believe this new technique will be particularly useful for drug screening and for generating previously unobtainable respiratory data on small mitochondrial samples.

High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.

Technologies r&#xE9;cemment d&#xE9;velopp&#xE9;es ont permis multi-puits de mesure de O (2) la consommation, ce qui facilite le taux de la recherche mitochondriale, en particulier en ce qui concerne le m&#xE9;canisme d&#x26;#39;action des m&#xE9;dicaments et des prot&#xE9;ines qui modulent le m&#xE9;tabolisme. Parmi ces technologies, l&#x26;#39;analyseur de Seahorse XF24 a &#xE9;t&#xE9; con&#xE7;u pour &#xEA;tre utilis&#xE9; avec des cellules intactes attach&#xE9;s en une monocouche sur une plaque multi-puits de culture de tissu. Afin d&#x26;#39;avoir un syst&#xE8;me de dosage &#xE0; haut d&#xE9;bit dans lequel la demande d&#x26;#39;&#xE9;nergie et la disponibilit&#xE9; du substrat peuvent &#xEA;tre &#xE9;troitement contr&#xF4;l&#xE9;s, nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; un protocole d&#x26;#39;&#xE9;tendre l&#x26;#39;application de l&#x26;#39;analyseur de XF24 pour inclure mitochondries isol&#xE9;es. Acquisition des taux optimaux n&#xE9;cessite des conditions d&#x26;#39;essai qui sont de fa&#xE7;on inattendue distincts de ceux de la polarographie classique. Les conditions optimis&#xE9;es, issues des exp&#xE9;riences avec du foie de souris mitochondries isol&#xE9;es, de permettre le multi-bien l&#x26;#39;&#xE9;valuation des taux de la respiration et la production de protons par joint mitochondries vers le bas de la plaque d&#x26;#39;essai XF, et n&#xE9;cessitent des quantit&#xE9;s extr&#xEA;mement faibles de mat&#xE9;riau (pg 1-10 de prot&#xE9;ine mitochondriale par puits). Mesure s&#xE9;quentielle de base, &#xC9;tat 3, &#xC9;tat 4, et d&#xE9;coupleur-stimul&#xE9; la respiration peut &#xEA;tre faite dans chaque puits gr&#xE2;ce &#xE0; l&#x26;#39;ajout de r&#xE9;actifs &#xE0; partir des ports d&#x26;#39;injection. Nous d&#xE9;crivons l&#x26;#39;optimisation et la validation de cette technique en utilisant le foie de souris isol&#xE9; et le c&#x153;ur de rat mitochondries, et d&#x26;#39;appliquer l&#x26;#39;approche de d&#xE9;couvrir que l&#x26;#39;inclusion d&#x26;#39;inhibiteurs de phosphatases dans la pr&#xE9;paration des r&#xE9;sultats mitochondries cardiaques dans une diminution des taux sp&#xE9;cifique du complexe I-d&#xE9;pendante la respiration. Nous croyons que cette nouvelle technique sera particuli&#xE8;rement utile pour le criblage de m&#xE9;dicaments et pour g&#xE9;n&#xE9;rer des donn&#xE9;es impossibles &#xE0; obtenir auparavant sur de petits &#xE9;chantillons respiratoires mitochondriales.

Hautes mesures de d&#xE9;bit respiratoire au moyen de microplaques des quantit&#xE9;s minimales de mitochondries isol&#xE9;es

Vor kurzem haben entwickelte Technologien erm&ouml;glicht multi-well Messung von O(2) Verbrauch, die Rate der mitochondrialen Forschung zu erleichtern, insbesondere hinsichtlich der Wirkmechanismus von Drogen und Proteine, die Stoffwechsel zu modulieren. Unter diesen Technologien wurde der Seahorse-XF24-Analyzer zur Verwendung mit intakten Zellen in eine Monolage ein multi-well Gewebe-Kultur-Kennzeichen angebracht entworfen. Um einen hohen Durchsatz-Testsystem in dem sowohl Energie-Nachfrage und Substrat-Verf&uuml;gbarkeit streng kontrolliert werden kann, haben wir ein Protokoll, um die Anwendung des XF24 Analyzer isolierte Mitochondrien zu erweitern entwickelt zu haben. Erwerb der optimale Preise erfordert Assay-Bedingungen, die unerwartet getrennt von denen der herk&ouml;mmlichen Polarographie sind. Die optimierten Bedingungen, abgeleitet von den Experimenten mit Leber isoliert Maus Mitochondrien, erm&ouml;glichen multi-well Bewertung der Preise der Atmung und der Proton-Produktion von Mitochondrien, die an der Unterseite der XF-Assay-Platte befestigt und extrem kleine Mengen von Material (1-10 &micro;g mitochondrial Protein pro Well) erfordern. Sequenzielle Messung der basal, State 3, Zustand 4 und Entkuppler stimuliert Atmung in jede Vertiefung durch Zus&auml;tze von Reagenzien von den H&auml;fen Injektion m&ouml;glich. Wir beschreiben, Optimierung und Validierung dieser Technik mit Leber isoliert Maus und Ratte Herz Mitochondrien, und wenden den Ansatz, dass die Aufnahme der Phosphatase-Inhibitoren bei der Vorbereitung des Herzen Mitochondrien ergibt einen spezifischen R&uuml;ckgang der Preise der komplexen-abh&auml;ngige Atmung zu entdecken. Wir glauben, dass diese neue Technik wird vor allem f&uuml;r Drogen-Screening und zum Generieren von zuvor unerreichbare Atemwege Daten auf kleine mitochondriale Proben.

Hochdurchsatz Microplatte Atemwege Messungen mit minimale Mengen an isolierten Mitochondrien.

Recentemente sviluppati tecnologie hanno permesso a piastre multi-pozzetto misurazione del consumo di apparato, facilitando la frequenza di ricerca mitocondriale, specialmente per quanto riguarda il meccanismo d&#39;azione dei farmaci e delle proteine che modulano il metabolismo. Tra queste tecnologie, il cavalluccio marino XF24 Analyzer &egrave; stato progettato per uso con cellule intatte attaccate in un monostrato ad una piastra di coltura del tessuto piastre multi-pozzetto. Al fine di avere un sistema di dosaggio ad alta velocit&agrave; effettiva in cui sia disponibilit&agrave; richiesta e substrato energetico pu&ograve; essere strettamente controllata, abbiamo sviluppato un protocollo per espandere l&#39;applicazione dell&#39;analizzatore XF24 per includere i mitocondri isolati. Acquisizione di tariffe ottimale richiede condizioni di dosaggio che sono inaspettatamente distinte da quelle di Polarografia convenzionale. Le condizioni ottimizzate, derivate da esperimenti con i mitocondri isolati mouse fegato, consentono piastre multi-pozzetto valutazione dei tassi di respirazione e di produzione di protoni da mitocondri attaccati al fondo della piastra di dosaggio XF e richiedono quantit&agrave; estremamente ridotte di materiale (1-10 &micro; g di proteina mitocondriale per pozzetto). Misurazione sequenziale di basale, stato 3, stato 4 e respirazione sono stimolati pu&ograve; essere fatto in ogni pozzetto attraverso aggiunte di reagenti dai porti di iniezione. Ci descrivono ottimizzazione e convalida di questa tecnica utilizzando il fegato di topo isolato e mitocondri di cuore di ratto e applicare l&#39;approccio per scoprire che l&#39;inclusione degli inibitori di fosfatasi nella preparazione dei risultati di mitocondri di cuore in una diminuzione nei tassi di respirazione-dipendente complessi specifico. Crediamo che questa nuova tecnica sar&agrave; particolarmente utile per lo screening di stupefacenti e per la generazione di dati precedentemente irraggiungibile respiratori su piccoli campioni mitocondriali.

High throughput micropiastra respiratoria misurazioni utilizzando minime quantit&agrave; di mitocondri isolati.

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Tecnolog&#xED;as desarrolladas recientemente han permitido m&#xFA;ltiples pocillos medici&#xF3;n de O (2) el consumo, lo que facilita la tasa de la investigaci&#xF3;n mitocondrial, particularmente con respecto al mecanismo de acci&#xF3;n de los f&#xE1;rmacos y las prote&#xED;nas que modulan el metabolismo. Entre estas tecnolog&#xED;as, el analizador Seahorse XF24 fue dise&#xF1;ado para uso con c&#xE9;lulas intactas unidos en una monocapa a una placa de tejido de m&#xFA;ltiples pocillos. Con el fin de tener un sistema de ensayo de rendimiento alto en el que puede ser tanto la demanda de energ&#xED;a y la disponibilidad de sustrato estrechamente controlada, hemos desarrollado un protocolo para ampliar la aplicaci&#xF3;n del Analizador XF24 para incluir las mitocondrias aisladas. Adquisici&#xF3;n de las tasas &#xF3;ptimas requiere de condiciones de ensayo que son inesperadamente distintos de los de la polarograf&#xED;a convencional. Las condiciones optimizadas, derivadas de los experimentos con h&#xED;gado de rat&#xF3;n mitocondrias aisladas, permiten m&#xFA;ltiples pocillos evaluaci&#xF3;n de las tasas de respiraci&#xF3;n y la producci&#xF3;n de protones por adjunto mitocondrias a la parte inferior de la placa de ensayo XF, y requieren cantidades muy peque&#xF1;as de material (1-10 microgramos de prote&#xED;na mitocondrial por pocillo). Medici&#xF3;n secuencial de basales, Estado 3, Estado 4, y desacoplador estimulada por la respiraci&#xF3;n puede hacerse en cada pocillo a trav&#xE9;s de las adiciones de reactivos de los orificios de inyecci&#xF3;n. Se describe la optimizaci&#xF3;n y validaci&#xF3;n de esta t&#xE9;cnica utilizando h&#xED;gado de rat&#xF3;n y el coraz&#xF3;n de rata aislado mitocondrias, y aplicar el enfoque para descubrir que la inclusi&#xF3;n de inhibidores de la fosfatasa en la preparaci&#xF3;n de los resultados del coraz&#xF3;n mitocondrias en una disminuci&#xF3;n espec&#xED;fica en las tasas de complejo I-dependiente respiraci&#xF3;n. Creemos que esta nueva t&#xE9;cnica ser&#xE1; especialmente &#xFA;til para la detecci&#xF3;n de drogas y para la generaci&#xF3;n de datos de las v&#xED;as respiratorias ya imposibles de conseguir en peque&#xF1;as muestras mitocondriales.

Las mediciones de microplacas de alto rendimiento respiratorio por medio de m&#xED;nimas cantidades de mitocondrias aisladas

Facilitated pyruvate transport across the mitochondrial inner membrane is a critical step in carbohydrate, amino acid, and lipid metabolism. We report that clinically relevant concentrations of thiazolidinediones (TZDs), a widely used class of insulin sensitizers, acutely and specifically inhibit mitochondrial pyruvate carrier (MPC) activity in a variety of cell types. Respiratory inhibition was overcome with methyl pyruvate, localizing the effect to facilitated pyruvate transport, and knockdown of either paralog, MPC1 or MPC2, decreased the EC50 for respiratory inhibition by TZDs. Acute MPC inhibition significantly enhanced glucose uptake in human skeletal muscle myocytes after 2 h. These data (i) report that clinically used TZDs inhibit the MPC, (ii) validate that MPC1 and MPC2 are obligatory components of facilitated pyruvate transport in mammalian cells, (iii) indicate that the acute effect of TZDs may be related to insulin sensitization, and (iv) establish mitochondrial pyruvate uptake as a potential therapeutic target for diseases rooted in metabolic dysfunction.

Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.

Dysregulation of oxidative phosphorylation is associated with increased mitochondrial reactive oxygen species production and some of the most prevalent human diseases including obesity, cancer, diabetes, neurodegeneration, and heart disease. Chemical 'mitochondrial uncouplers' are lipophilic weak acids that transport protons into the mitochondrial matrix via a pathway that is independent of ATP synthase, thereby uncoupling nutrient oxidation from ATP production. Mitochondrial uncouplers also lessen the proton motive force across the mitochondrial inner membrane and thereby increase the rate of mitochondrial respiration while decreasing production of reactive oxygen species. Thus, mitochondrial uncouplers are valuable chemical tools that enable the measurement of maximal mitochondrial respiration and they have been used therapeutically to decrease mitochondrial reactive oxygen species production. However, the most widely used protonophore uncouplers such as carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) and 2,4-dinitrophenol have off-target activity at other membranes that lead to a range of undesired effects including plasma membrane depolarization, mitochondrial inhibition, and cytotoxicity. These unwanted properties interfere with the measurement of mitochondrial function and result in a narrow therapeutic index that limits their usefulness in the clinic. To identify new mitochondrial uncouplers that lack off-target activity at the plasma membrane we screened a small molecule chemical library. Herein we report the identification and validation of a novel mitochondrial protonophore uncoupler (2-fluorophenyl){6-[(2-fluorophenyl)amino](1,2,5-oxadiazolo[3,4-e]pyrazin-5-yl)}amine, named BAM15, that does not depolarize the plasma membrane. Compared to FCCP, an uncoupler of equal potency, BAM15 treatment of cultured cells stimulates a higher maximum rate of mitochondrial respiration and is less cytotoxic. Furthermore, BAM15 is bioactive in vivo and dose-dependently protects mice from acute renal ischemic-reperfusion injury. From a technical standpoint, BAM15 represents an effective new tool that allows the study of mitochondrial function in the absence of off-target effects that can confound data interpretation. From a therapeutic perspective, BAM15-mediated protection from ischemia-reperfusion injury and its reduced toxicity will hopefully reignite interest in pharmacological uncoupling for the treatment of the myriad of diseases that are associated with altered mitochondrial function.

Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.

Measurements of mitochondrial respiration in intact cells can help define metabolism and its dysregulation in fields such as cancer, metabolic disease, immunology, and neurodegeneration. Although cells can be offered various substrates in the assay medium, many cell types can oxidize stored pools of energy substrates. A general bioenergetic profile can therefore be obtained using intact cells, but the inability to control substrate provision to the mitochondria can restrict an in-depth, mechanistic understanding. Mitochondria can be isolated from intact cells, but the yield and quality of the end product is often poor and prone to subselection during isolation. Plasma membrane permeabilization of cells provides a solution to this challenge, allowing experimental control of the medium surrounding the mitochondria. This unit describes techniques to measure respiration in permeabilized adherent cells using a Seahorse XF Analyzer or permeabilized suspended cells in a Hansatech Oxygraph. Curr. Protoc. Toxicol. 60:25.2.1-25.2.16. © 2014 by John Wiley & Sons, Inc.

Measuring Mitochondrial Function in Permeabilized Cells Using the Seahorse XF Analyzer or a Clark-Type Oxygen Electrode.

Fatty acid beta oxidation is a major pathway of energy metabolism and occurs primarily in mitochondria. Drug-induced modulation of this pathway can cause adverse effects such as liver injury, or be beneficial for treating heart failure, type 2 diabetes, and obesity. Hence, in vitro assays that are able to identify compounds that affect fatty acid oxidation are of value for toxicity assessments, as well as for efficacy assessments. Here, we describe two high-throughput assays, one for assessing fatty acid oxidation in cells and the other for assessing fatty acid oxidation in isolated rat liver mitochondria. Both assays measure fatty acid-driven oxygen consumption and can be used for rapid and robust screening of compounds that modulate fatty acid oxidation. Curr. Protoc. Toxicol. 60:25.3.1-25.3.19. © 2014 by John Wiley & Sons, Inc.

Assessment of Fatty Acid Beta oxidation in cells and isolated mitochondria.

Numerous investigations have linked mitochondrial dysfunction to adverse health outcomes and drug-induced toxicity. The pharmaceutical industry is challenged with identifying mitochondrial liabilities earlier in drug development and thereby reducing late-stage attrition. Consequently, there is a demand for reliable, higher-throughput screening methods for assessing the impact of drug candidates on mitochondrial function. The extracellular flux (XF) assay described here is a plate-based method in which galactose-conditioned HepG2 cells were acutely exposed to test compounds, then real-time changes in the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate were simultaneously measured using a Seahorse Bioscience XF-96 analyzer. The acute XF assay was validated using marketed drugs known to modulate mitochondrial function, and data analysis was automated using a spline curve fitting model developed at GlaxoSmithKline. We demonstrate that the acute XF assay is a robust, sensitive screening platform for evaluating drug-induced effects on mitochondrial activity in whole cells.

The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function.

Mitochondrial oxidative-phosphorylation produces most of the energy in aerobic cells by coupling respiration to the production of ATP. Mitochondrial uncouplers, which reduce the proton-gradient across the mitochondrial inner membrane, create a futile cycle of nutrient oxidation without generating ATP. Regulation of mitochondrial dysfunction and associated cellular bioenergetics has been recently identified as promising targets for anticancer therapy. Here, we show that SR4 is a novel mitochondrial uncoupler that causes dose-dependent increase in mitochondrial respiration and dissipation of mitochondrial-membrane-potential (MMP) in HepG2 hepatocarcinoma cells. These effects were reversed by the recoupling agent 6-ketocholestanol, but not cyclosporin A, and were non-existent in mitochondrial-DNA depleted HepG2 (po) cells. In isolated mouse liver mitochondria, SR4 similarly increased oxygen consumption independent of adenine nucleotide translocase and uncoupling proteins, decreases MMP, and promotes swelling of valinomycin-treated mitochondria in potassium acetate media. Mitochondrial uncoupling in HepG2 cells by SR4 results in the reduction of cellular ATP production, increased ROS production, activation of the energy-sensing enzyme AMPK, and inhibition of acetyl-CoA carboxylase and mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathways, leading to cell cycle arrest and apoptosis. Global analysis of SR4-associated differential gene expression confirms these observations, including significant induction of apoptotic genes and down regulation of cell cycle, mitochondrial and oxidative-phosphorylation pathway transcripts at 24 h post treatment. Collectively, our studies demonstrate that SR4's previously reported indirect activation of AMPK and in-vitro anticancer properties, as well as its beneficial effects in both animal xenograft and obese-mice models could be a direct consequence of its mitochondrial uncoupling activity.

Article Total : 5	Year
Publication title	2010
Publication title	2015
Publication title	2015
Publication title	2015
Publication title	2017

Article	Year
eIF4A: the godfather of the DEAD box helicases. Progress in nucleic acid research and molecular biology\| PubMed ID: 12206455	2002
Differential utilization of upstream AUGs in the beta-secretase mRNA suggests that a shunting mechanism regulates translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 14981268	2004
High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one\| PubMed ID: 21799747	2011
Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 23513224	2013
Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular metabolism\| PubMed ID: 24634817	2014
Measuring Mitochondrial Function in Permeabilized Cells Using the Seahorse XF Analyzer or a Clark-Type Oxygen Electrode. Current protocols in toxicology / editorial board, Mahin D. Maines (editor-in-chief) ... [et al.]\| PubMed ID: 24865646	2014
Assessment of Fatty Acid Beta oxidation in cells and isolated mitochondria. Current protocols in toxicology / editorial board, Mahin D. Maines (editor-in-chief) ... [et al.]\| PubMed ID: 24865647	2014
The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function. Journal of biomolecular screening\| PubMed ID: 25381255	2014
SR4 Uncouples Mitochondrial Oxidative Phosphorylation, Modulates AMPK-mTOR Signaling, and Inhibits Proliferation of HepG2 Hepatocarcinoma Cells. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 26534958	2015

George W. Rogers

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