Name: using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements
Uploaded: 2015-10-30T14:00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements at JoVE.com

The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол начинается после одного изолированы митохондрии из красного скелетных мышц. Митохондрии были выделены, как описано выше в ~ 75 - 100 мг красного скелетных мышц 13. Между 5 - 10 мкг / мкл белка митохондрий будут достигнуты из этого количества ткани ресуспендированием окончательного митохондриальной гранул в ≤50 мкл буфера для изоляции митохондрий (IBM) 2 (см Frisard др 13). 1. Настройка <ol><li> Подготовка работы исходные растворы (таблица 1) и митохондриальной Анализируемый раствор (MAS) смеси (таблица 2) для последующих анализов. Примечание: Большая часть подготовки к анализов может быть сделано заранее, так как большинство запасов решения и МАС могут быть сохранены. </li><li> Гидрат А respirometric картридж анализа в 1 мл калибровочного раствора в ночь перед экспериментом в не-СО 2 инкубаторе при 37 ° С. </li><li> В день эксперимента, тAKE из замороженных запасов (субстраты и модуляторы, митохондриальные МАС смешивания, MAS без BSA, Таблица 1) и оттепель в 37 ° C бане или инкубатора. </li><li> Подготовьте все решения субстрата (таблица 3) и инъекции (таблица 4-5) и отрегулируйте рН по желанию (рН 7,4). После того, как рН, хранить на льду. </li><li> Программа мульти-хорошо потребление кислорода измерения машина правильной смеси, ждать, и параметров меры (см Таблицу 6) и этикетки фон и группа / состояние скважин первом входе в программное обеспечение для анализа, а затем в режиме «Стандарт». <ol><li> Введите в &quot;Гостевой&quot; форум и нажмите на кнопку &quot;пробирной Wizard&quot;. После того, как в &quot;пробирной Wizard&quot;, щелкните на &quot;Протокол&quot;, чтобы изменить микс, ждать, и измерения параметров. Этикетка фона скважин под &quot;Back. Коррекция &quot;на вкладке и убедитесь, что выделить&quot; У коррекцию фона &quot;. </li><li> Этикетка услitions щелкнув сначала на вкладке &quot;Группы и знаки&quot;, а затем на вкладке &quot;Группа&quot;. Информация После эти параметры введены, нажмите &quot;Завершить&quot;, а затем &quot;Сохранить шаблон&quot;. </li></ol></li></ol> 2. Анализ Выполнить <ol><li> Загрузите растворы для инъекций, в преддверии картриджа анализа и начать калибровку первом входе в программное обеспечение для анализа, а затем, введя &quot;Стандартный&quot; режим. Введите в &quot;Гостевой&quot; форума. Откройте шаблон, сохраненный в шаге 1.5 под диск &quot;XF&quot;, на вкладке &quot;Шаблоны&quot;. После того, как открытый, нажмите кнопку &quot;Пуск&quot;, чтобы начать калибровку. Примечание: Пробег картридж анализ должен быть введен в машину с зубчатым угла в левом нижнем углу. Это займет около 30 мин. Позаботьтесь, чтобы придать решения в соответствующие порты. Инъекции в таблице 4-5 перечислены в порядке загрузки. </li><li> Аккуратно, но тщательно перемешать mitochondРИА складе при перемешивании раствора с наконечником пипетки в 200 мкл с последующим растиранием аккуратно запас с наконечником пипетки в 200 мкл, который имел свою отверстие расширенную резанием ~ 3 мм от конца наконечника с помощью ножниц. </li><li> Выполнение бицинхониновой кислоты (BCA) Анализ для определения концентрации белка в митохондриальной складе. </li><li> Использование концентрации акций, приобретенная из стадии 2.3, ресуспендируют 10 мкг белка / митохондриальной 200 мкл сукцината / ротеноном смеси субстрата (таблица 3). Ресуспендируют 14 мкг белка митохондрий / 200 мкл субстрата остальных смесей (Это должно быть сделано для каждой смеси субстрата) (таблица 3). Поместите все митохондрий белок / субстрат смеси на льду. Примечание: Оптимальное количество белка митохондрий на лунку для каждого анализа было определено, как описано выше 9. Было установлено, что пируват / малат, пальмитоил карнитина / малат, глутамат / малатD анализы электронов течением используют 3,5 мкг белка митохондрий, в то время как сукцинат / ротенон набора использует 2,5 мкг белка митохондрий на лунку. Таким образом, исследователь должен ресуспендируйте достаточно белка митохондрий для 4 размножается в этом шаге, так как либо 2,5 мкг или 3,5 мкг на 50 мкл загружается на лунку (см шаг 2,6). </li><li> Смешайте решения митохондрии / подложки аккуратно, но тщательно перемешивали раствор с кончика пипетки 200 мкл, а затем осторожно растирая акции с кончика пипетки 200 мкл, который имел ~ 3 мм его конце обрезаются. </li><li> Поместите культуральный планшет на льду и трижды, нагрузка 50 мкл / лунку каждого из митохондрий / субстрата смесей. Разработчики микропланшетов основе анализа respirometric рекомендуем оставить минимум две пустые (без митохондрий) скважин, предпочтительно по обе стороны на культуре клеток пластину. </li><li> Спин культуре клеток пластину при 2000 г в течение 20 мин при 4 ° С. В то время как пластина сзакрепления, разогреть решения подложки на водяной бане 37 ° C. </li><li> После спин завершена, тщательно загрузки 450 мкл каждого раствора субстрата в верхней части его соответствующие лунки (т.е. загрузить пируват / малата подложку в лунки, которые имеют митохондрии первоначально ресуспендировали в этом растворе субстрата). Будьте уверены, чтобы загрузить пластину при комнатной температуре. Примечание: контрольные лунки должны быть загружены с 500 мкл субстрата. Контрольные лунки, предназначенные для анализа потока электронов должен быть загружен с электронным потоком субстрата (пируват / малат + FCCP), в то время как в сочетании анализа пустые лунки может быть загружен с любым муфты анализа подложки. Примечание: При выполнении связанной и электронные анализы потока на той же пластинке, исследователь должен передать фона скважин соответствующих анализов после анализа выполнения завершения использования платформы &quot;XF Reader&quot; на вкладке &quot;Инструмент&quot;. После того, как в настройке &quot;инструмент&quot;, нажмите на &quot;администрации&quot;Вкладка, а затем &quot;коррекция фона&quot;. Хит &quot;Конец инструмента в режим настройки&quot;, когда завершена. Это потому, что сочетание аскорбат / ТМФД может потреблять О 2, таким образом, отдельное коррекции фона, необходимое для каждого типа анализа. </li><li> После того, как 450 мкл субстрата в каждую лунку добавляли, просматривать слой митохондрий в скважине, чтобы обеспечить митохондрии равномерно распределен в одном монослое (20X увеличение [см Rogers 9, рис 4]). Уэллс, что, кажется, не имеют равномерно распределенную монослой могут быть удалены постфактум. </li><li> После проверки митохондриальной приверженности, вставьте планшет в respirometric анализа документа и начать анализ запуска, нажав кнопку &quot;OK&quot;. Примечание: Калибровка с шага 2.1 должен быть полным, прежде чем запустить начнется. После того, как исследователь нажимает &quot;ОК&quot;, машина будет извлечь утилиту пластину, которая была использована для калибровки. <ol> &lt;LI&gt; Удалить утилиту тарелку и поставить культуру пластину клеток, который содержит митохондрии в лоток. Синий выемка на планшет для культивирования клеток должны быть размещены в нижнем левом углу лотка. Нажмите на &quot;продолжить&quot;, чтобы начать работать анализа. </li></ol></li><li> После запуска завершена, извлеките клеточной культуры пластины и картриджа, нажав &quot;Eject&quot; на экране. <ol><li> После того, как пластины выбрасывается, снимите и выбросьте культуре клеток пластину и картридж и нажмите &quot;Продолжить&quot; на экране. Пробег будут автоматически сохранены в виде файла .xls в файле &quot;Data&quot;. </li></ol></li><li> Откройте этот файл и изменить отображение из &quot;O2&quot; в &quot;OCR&quot;, нажав стрелку вниз под &quot;Y1:&quot; маркер. <ol><li> Следующее изменение &quot;средняя точка&quot; в &quot;Точка-точка ставок&quot; под &quot;скоростью передачи данных отображается как:&quot; вариант. Нажмите кнопку &quot;OK&quot;, чтобы применить эти изменения. </li></ol&gt; </li><li> Перейдите на вкладку &quot;Mode Группа Ну&quot; на левой нижней части экрана на группы скважин подобных условиях вместе. Наконец, нажмите кнопку &quot;Выборочное среднее / стандартная ошибка&quot; вкладку к середине экрана, слева. Кроме того, эти команды могут быть установлены до анализа начинается в обстановке &quot;Мастер анализа&quot;. Примечание: Каждое условие будет иметь значение ± стандартное отклонение отображаемого для каждого курса и каждого состояния. Есть измерения скорости, принятые в условие (2 государства [Сцепление] / State3u [электронный поток] дыхание следуют четыре инъекции). Используйте среднее состояние 2 скорости второго измерения, определить государство 4o в точке минимума после олигомицину инъекции, используйте точку максимальной для государства 3 и Государственной 3U после АДФ и FCCP инъекции, соответственно, и использовать минимальную температуру для антимицин А индуцированных дыхания для муфты анализов. Используйте максимально точкой для пирувата / малат индуцированной государственного 3u дыхания, используйте минимумточка для ротеноном индуцированных дыхания, использовать максимальное точкой для сукцината индуцированной Государственный 3u дыхания, и использовать минимальную температуру для Антимицина A индуцированного дыхания для анализа потока электронов. Все эксперименты проводили 3 раза, а данные, приведенные результаты представительного трассировки. </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435, 297-312 (2011).</li><li>Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+muscle+mitochondrial+DNA+content,+mitochondrial+enzyme+activity+and+oxidative+capacity+in+man:+alterations+with+disease.">Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease.</a> European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).</li><li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence.">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li><li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance,+metabolic+flexibility,+and+mitochondrial+performance.">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).</li><li>Disease Control and Prevention Services. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+diabetes+statistics+report:+estimates+of+diabetes+and+its+burden+in+the+United+States.">National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States.</a> , (2014).</li><li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration.">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).</li><li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes.">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746 (2011).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+levels+of+lipopolysaccharide+modulate+mitochondrial+oxygen+consumption+in+skeletal+muscle.">Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle.</a> Metabolism. 64, 416-427 (2015).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathways+and+respiratory+control.">Mitochondrial pathways and respiratory control.</a> , (2007).</li></ol>

Джордж Роджерс является сотрудником Морской конек Bioscience, которая производит инструмент, для которого были разработаны эти анализы.

Методы, представленные в этой статье предоставить шаг за шагом инструкции для выполнения коллекции микропланшета на основе анализа с использованием respirometric митохондрии, выделенные из 75 - 100 мг мыши скелетных мышц. Эти анализы могут быть выполнены с высокой точностью, о чем свидетельствует плотный стандартное отклонение между трех лунок. Важно, что эти анализы позволяют respirometric выявлении, где нарушения и / или адаптации может происходить в т.д., ЦТК, β-окисления токопровод, подложка транспортеры, и т.д., в обычно используемом животной модели. Это важно подчеркнуть, обоснование использования различных видов топлива и ингибиторы, используемые в настоящем протоколе. Пируват / малат и глутамат / малат respirometric анализы позволяют для оценки Комплекс I, опосредованного дыхания, а также при оценке их соответствующих транспортеров, и в случае глутамат, в Аденозиндеминазный 15. Кроме того, сочетаниесукцинат / ротенон позволяет оценить митохондриальной дыхательной потока через комплекс II в ЕТС, так ротенон ингибирует комплекс I и сукцинат обеспечивает электроны комплекса II с помощью сокращения флавинадениндинуклеотид (FADH 2) 15. Эти анализы обеспечивают подложку конкретную информацию об эффективности связи и максимальной дыхания. Анализ электронный поток является уникальным в том, что сочетание подложки и ингибиторов позволяет оценить нескольких комплексов во митохондриальной дыхательной потока 9. Начальная смесь субстрат пирувата / малат + FCCP позволяет для оценки максимального дыхания обусловлен комплекс I, в то время как инъекции ротенона последующим сукцината позволяет оценка максимального дыхания обусловлен комплексом II. Инъекция антимицина А, ингибитор комплекса III, с последующим введением аскорбиновой кислоты / TMPD позволить для оценки дыхания обусловлен комплекса IV, так как аскорбат / TMPD являетсядонора электронов для цитохрома С / комплекса IV. В то время как нет информации об эффективности связи не получается, метод идеально подходит для очень малых размеров выборки, которые исключают запуска нескольких подложек самостоятельно. Наконец, использование пальмитоил карнитина / малат позволяет оценить координации между -окисления и т.д. с восстанавливающим эквивалента от окисления пальмитиновой кислоты (бета-окисления) подается в ETC через электрона передающей флавопротеид 15. Следует отметить, что поток пробы Сцепление и Electron также могут быть использованы в сочетании, чтобы идентифицировать изменения в функции митохондрий из-за некоторого вмешательства (лечения препарат, генетической манипуляции). Высокая точность достигается для этих анализов, прежде всего, из-за тщательного перемешивания митохондрий, является ли это до определения белка, или с решениями подложки. Вдоль этих линий, как только митохондрии resuspendend в подложке SOLUTIOнс, важно, чтобы смешать это решение тщательно перед загрузкой культуру пластину клеток, как описано в шаге 2.2 с расширенной отверстие наконечника пипетки. Отказ смешивать митохондрии тщательно приведет к большим изменением в анализе. Кроме того, с помощью узкой пипетки отверстия создаст силы сдвига при смешивании митохондрии и увеличивает потенциал, чтобы повредить митохондриальных мембран и высвобождение цитохрома С. шаг соблюдение (2.7) также является важным шагом в этом протоколе. Отказ вращаться загруженный клеточной культуры пластину длинный / достаточно быстро приведет к неполной приверженности митохондрий в скважину, что приводит повышенной изменчивости между скважинами и измерений. Описанный протокол был оптимизирован для включают в себя: загрузка оптимальное количество белка митохондрий на лунку, используя правильные концентраций / методы подготовки, чтобы сделать акции и подложки решения, изменения анализа бежать, чтобы обеспечить митохондриальной государственной плаteaus, и целесообразно смешивание митохондриальных фондовых и митохондриальной / подложки смесей. До этих усилий по оптимизации, авторы столкнулись ловушек в аналитическом счете. Ниже обсуждаются способы устранения неполадок / модификации, которые были полезны в оптимизации этого протокола. Что касается оптимальной загрузки, загрузка слишком мало митохондрий не вызовет надежную реакцию, при загрузке слишком много митохондрий исчерпает кислород в микрокамеры и привести к неточным измерениям. Роджерс и др 9 приведены примеры определения оптимальных объемов погрузки митохондрий на лунку для микропланшетов основе respirometric анализов. Чаще слишком много митохондрий загружен в также свидетельствует состоянии 2 ставки в течение 100-200 пмоль / мин / хорошо и состояние 3 ставки&gt; 1500 пмоль / мин / лунку. Если в течение погрузка осуществляется, провести эксперимент с различной концентрацией митохондрий белка (например, между 1 -. 10 мкг), чтобы вызвать OCRs в пределах динамического гAnge измерительной машины потребления кислорода. Подготовка и использование правильных концентраций субстратов и запасов имеет первостепенное значение. Всегда использовать кислотную форму субстратов / инъекций и доведения рН с гидроксидом калия или HCl; буферы натрия / решения не рекомендуется. Кроме того, ресуспендированием субстраты / запасы в ДМСО или 100% этанола приведет к повреждению измерительного или ошибок. Будьте уверены, чтобы использовать 95% этанол где отмечено. Она является общей для пальмитоил карнитина для осаждения из 95% этанола после оттаивания замороженного акции, тем самым вызывая большой изменчивостью. Будьте уверены, чтобы разогреть пальмитоил карнитина акции и вихрь хорошо перед использованием. Кроме того, сильно варьирует пируват / малат результат анализа может быть связано с пируват фондовой существа&gt; 2 недель. Будьте уверены, чтобы переделать замороженные аликвоты пирувата каждые 2 недели. Анализ выполнения был изменен, чтобы измерения 2-минутных обеспечить митохондриальных государственные плато. Если наблюдение истощения АДФ желательно, исследователь можетпродлить время измерения на вкладке «Протокол» в рамках проекта «Мастер анализа&quot; форума. Наконец, большая изменчивость возникает, когда митохондриальной фондовые и митохондрий плюс подложки решения не гомогенизировали полностью до погрузки. Если изменчивость между скважинами высокая после анализа перспективе, убедитесь, что в полной мере смешивания раствора субстрата до следующего эксперимента. Никогда вихрь решения митохондрии / подложки, а перемешать, пюре и аккуратно растирать с расширенной отверстие наконечника пипетки. Есть некоторые ограничения этого метода, которые стоит отметить. Во-первых, количество скважин на культуральный планшет, используемый для этих анализов является относительно низким (т.е.., 24 скважин и, по меньшей мере 2, предназначенных для контрольных лунок). Если желательно, чтобы выполнить все 5 из этих анализов на одной пластине, исследователь может только рассмотреть ответы от одной мыши одновременно. Тем не менее, следует отметить, что 96-луночные инструменты для ВЫСОг пропускную способность. Во-вторых, есть сила и слабость в оценке дисфункцию митохондрий в изолированных митохондриях по сравнению с в интактных клетках 1. Некоторые недостатки включают наличие менее физиологическое значение по сравнению с интактными клетками и вызывающих артефакты из процесса выделения. Наконец, успех этого метода будет зависеть от качества процесса изоляции митохондрий. Хотя некоторые из этих анализов были либо разработаны в различных системах или были подтверждены в других моделях на животных, методы, представленные здесь, являются первым, чтобы синтезировать все вышеупомянутые анализов для оптимального использования в нескольких хорошо измерение машина потребление кислорода с помощью мыши скелетная мышца. Важно отметить, что все 5 из этих анализов могут быть выполнены с количеством митохондрий, выделенных из ~ 75 - 100 мг мыши скелетных мышцах, обеспечивая тем самым высокую пропускную способность при минимальном материала. Большое значение, способность мульти-колодцатехнологии потребления кислорода для выполнения анализов с минимальными количествами митохондрий, в сочетании с оптимизированной методом изоляции, позволяет исследователю выполнять множество других экспериментов с остатком скелетной мышечной ткани (например,., западных пятна, ОТ-ПЦР, ферментативных анализы, и т.д.), который часто является борьба с этой модели на животных. В заключение, методы, представленные в данном документе, шаг за шагом инструкции для выполнения коллекции микропланшета на основе анализа с использованием respirometric минимальные количества мыши скелетных мышц. Важно отметить, что представленные методы требуют минимальных количеств ткани и митохондрий. После освоено, описанные здесь позволит исследователям определить потенциальный механизм соединения или генного продукта в митохондриальной потребления кислорода в обычно используемом животной модели.

Основная физиологическая роль скелетных мышц митохондриями является производство АТФ из окислительного фосфорилирования 1. Важно отметить, что скелетные мышцы митохондрий играть определенную роль в физической нагрузки 2, 3 старения, дегенеративные заболевания 4 и Type II диабетом 5. Как стареющем обществе, и типа диабета II, являющегося 7-й ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах 6, потребность в способах, которые оценивают функции митохондрий становится все более более распространены в биомедицинских исследованиях 7,8. В частности, измерение потребления кислорода имеет исключительную полезность в оценке функции митохондрий, так как она представляет собой скоординированную функцию между митохондриальных геномов и ядерных выразить функциональные компоненты окислительного фосфорилирования 9. Несколько существуют технологии, позволяют измерение потребления кислорода в интактных клетках и изолироватьD митохондрии 7-10. Кроме того, анализы были разработаны для различных типов клеток и тканей, а также в различных видов, которые позволяют для измерения митохондриальных дыхательных путей и контроля 9,11,12. Тем не менее, в настоящее время существует пробел в литературе в отношении составления всех этих анализов с использованием изолированного митохондрии от мыши скелетных мышц для использования в микропланшета технологии потребления кислорода. Важно отметить, что использование микропланшетов основе respirometric анализов растет среди митохондриальных биологов и позволяет высоких измерений пропускной используя минимальные количества изолированными митохондриями 9. Таким образом, коллекция микропланшета на основе анализов respirometric были разработаны, которые позволяют выявлением, где аномалии и / или адаптации может происходить в электронно-транспортной цепи (ETC). Кроме того, предусмотрены две дополнительные микропланшет, основанные respirometric анализы были разработаны, которые позволяют оценку координации betweeп трикарбоновых кислот (ЦТК) цикл и т.д., и между бета-окисления и Т.Д. Важно отметить, что представленные методы обеспечивают четкое и краткое способ измерения механистические изменения в функции митохондрий в обычно используемой модели животного.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63559</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essentially Fatty&#160;</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A6003</td>
			<td rowspan="2">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Free- BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &#8805;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Glutamic acid</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">G1251</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">T7394</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99%, powder [TMPD]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A, &#8805; 95% (HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td>
			<td rowspan="3">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="3">C2920</td>
			<td rowspan="3">Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylhydrazone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8805;98% (TLC), powder [FCCP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A5285</td>
			<td rowspan="2">Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

Watch this Scientific Journal Video about Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements at JoVE.com

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Использование изолированными митохондриями из минимальных количествах мыши скелетных мышц для Высокая пропускная MICROPLATE респираторных измерений

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

using-isolated-mitochondria-from-minimal-quantities-mouse-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Выделение и количественный Иммуноцитохимическая Характеристика первичных Миогенные клеток и фибробластов из человеческих скелетных мышц

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from various somatic cell types by transducing four Yamanaka transcription factors: Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. The study of iPSCs remains at the cutting edge of biological and clinical research. In particular, patient-specific iPSCs can be used as a pioneering tool for the study of disease pathobiology, since iPSCs can be induced from the tissue of any individual. Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease, classified by the destruction of cartilage and bone structure in the joint. Synovial hyperplasia is one of the major reasons or symptoms that lead to these results in RA. Fibroblast-like Synoviocytes (FLSs) are the main component cells in the hyperplastic synovium. FLSs in the joint limitlessly proliferate, eventually invading the adjacent cartilage and bone. Currently, the hyperplastic synovium can be removed only by a surgical procedure. The removed synovium is used for RA research as a material that reflects the inflammatory condition of the joint. As a major player in the pathogenesis of RA, FLSs can be used as a material to generate and investigate the iPSCs of RA patients. In this study, we used the FLSs of a RA patient to generate iPSCs. Using a lentiviral system, we discovered that FLSs can generate RA patient-specific iPSC. The iPSCs generated from FLSs can be further used as a tool to study the pathophysiology of RA in the future.

Here we describe a protocol for generating human induced-pluripotent stem cells from patient-derived fibroblast-like synoviocytes, using a lentiviral system without feeder cells.

Генерация Индуцированные-плюрипотентных стволовых клеток с использованием фибробластоподобных синовиоциты Выделен из суставов больных ревматоидным артритом

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Индукция Острый скелетных мышц регенерации путем инъекций Cardiotoxin

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Подготовка и культура Миогенный прогениторных клеток / Первичные миобластов из скелетной мышце взрослых и выдержана Людей

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Выделение перицитов типа I и типа II из мышечных скелетных мышц

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

Применение хронической стимуляции для изучения сократительной активности индуцированной крыса скелетных мышц Фенотипическая адаптация

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Идентификации Спутниковое клеток скелетных мышц, иммунофлюоресценции с Pax7 и Ламинин антител

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

Рентгеновская дифракция институющих Морин скелетной мышцы в качестве инструмента для изучения структурной основы мышечной болезни

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.