Name: in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling
Uploaded: 2015-11-03T12:00:00
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Os autores gostariam de reconhecer as fontes de financiamento, incluindo a AHA (13GRNT16990019 para WT) e NHLBI (HL097246 e HL119371 para WT).

1. Silanização e biomolécula funcionalização de slide ou Policarbonato Membrana Nota: Muitos dos produtos químicos e soluções no âmbito deste protocolo têm altas taxas de evaporação (etanol (EtOH), acetona, etc.). Outros passos implicam tempos de incubação longos para taxas de evaporação baixas. Parafina filme é recomendado para selar recipientes. Cuidado: Muitos dos produtos químicos (tais como: ácido sulfúrico, acetona, (3-aminopropil) trietoxissilano, glutaralde...

<ol>
	<li>Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+co-culture+system+for+studying+mechanobiology+effects+of+pulse+flow+waves.">A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves.</a> Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening-Induced+High+Pulsatility+Flow+Activates+Endothelial+Inflammation+via+a+TLR2/NF-&#954;B+Pathway.">Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-&#954;B Pathway.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).</li><li>Wexler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Calcification:+Pathophysiology,+Epidemiology,+Imaging+Methods,+and+Clinical+Implications+A+Statement+for+Health+Professionals+From+the+American+Heart+Association.">Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association.</a> Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).</li><li>Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+fibrosis+in+atherosclerosis.">Vascular fibrosis in atherosclerosis.</a> Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+endothelial+recovery+and+reducing+neointimal+hyperplasia+using+sequential-like+release+of+acetylsalicylic+acid+and+paclitaxel-loaded+biodegradable+stents.">Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents.</a> Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).</li><li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Remodeling+in+Hypertension+Roles+of+Apoptosis+Inflammation,+and+Fibrosis.">Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis.</a> Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).</li><li>Greil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+carotid+artery+flow+velocities+after+stent+implantation:+a+fluid+dynamics+study+with+laser+Doppler+anemometry.">Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry.</a> J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).</li><li>Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+as+biomechanical+sensors+in+regulating+endothelial+function.">Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function.</a> Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).</li><li>Liu, S. Q., Goldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+blood+shear+stress+in+the+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+migration.">Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration.</a> IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).</li><li>Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pulsatility+flow+stimulates+smooth+muscle+cell+hypertrophy+and+contractile+protein+expression.">High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression.</a> AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).</li><li>Panaritis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatility+Index+of+Temporal+and+Renal+Arteries+as+an+Early+Finding+of+Arteriopathy+in+Diabetic+Patients..">Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients..</a> Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).</li><li>Miao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Flow+Patterns+on+the+Localization+and+Expression+of+VE-Cadherin+at+Vascular+Endothelial+Cell+Junctions:+In+vivo+and+in+vitro+Investigations.">Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations.</a> J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).</li></ol>

Este protocolo descreve um método de reprodução de fluxo pulsátil in vitro, e pode ser o primeiro passo fundamental para determinar a contribuição de condições de fluxo para patologias de doenças. Estudos anteriores, usando este protocolo ter encontrado condições de fluxo de contribuir para a resposta inflamatória vascular. 1, 10 Além disso, este protocolo destina-se a laboratórios experientes. Como tal, nem em profundidade mecânica dos fluidos, nem análise bioquímica é aqui descrit...

Taxas de morbidade para doenças cardiovasculares são a maior da América, com muitos resultante da vasculatura insalubre. As artérias saudáveis ​​consistem em tecido elástico, com a superfície luminal macia revestida com uma monocamada de células endoteliais (CE). Fluxo arterial pode ser modelado como uma função de onda oscilante com taxa média de fluxo positivo. O índice de pulsatilidade (PI) é o quociente de oscilação magnitude ea média de fluxo (PI = (Max. - Min.) / Média), 1 e foi modelado in vitro com a elasticidade dos vasos variável 2 Arterial elasticidade é importante no armazenamento do fluxo. energia a partir de contracções do coração, dilatando sob pressão sistólica, e desempenha um papel importante na modulação PI do fluxo sanguíneo. Porque o coração mantém um consistente, pulsátil, fluxo volumétrico, a expansão arterial aumenta a área de corte transversal, o reforço da estabilidade do fluxo, reduzindo a velocidade do fluxo, tensão de cisalhamento e PI. Freqüentemente, as artérias saudáveis ​​apresentam alterações a elasticidadeou de conformidade, exibindo enrijecimento de remodelação vascular, tecido cicatricial ou calcificação 3, 4. Além disso, outros distúrbios vasculares, tais como a hiperplasia neointimal (NIH), aneurisma 5 e 6 e hipertensão vascular fibrose 4, pode contrair o diâmetro dos vasos. No entanto, o tratamento medicamentoso atual e tratamento de doenças vasculares dispositivo muitas vezes negligenciar a importância da dinâmica de conformidade da parede do vaso ou do fluxo sanguíneo na doença vascular que é muitas vezes complicada por alterações na morfologia navio e propriedades. Nem a angioplastia com balão, nem implante de stent responder a complicação da parede elasticidade 7. Portanto, in vitro modelagem de fluxos de sangue resultante de doença arterial e tratamentos é importante na investigação de doenças e patologias futuro eficácia do tratamento. Aqui, nós descrevemos um método de replicar o fluxo sanguíneo fisiológico e patológico concebido para determinar a resposta de células na doença vascular Patholgias. O fluxo do fluido faz com que a tensão de cisalhamento na parede do vaso, que é um sinal mecânico importante na saúde dos vasos, que afecta todas as células no interior da vasculatura. Vários sensores mecânicos sobre o endotélio vascular de cisalhamento de fluidos, foram identificados, incluindo cílio primário mostrado em estudos recentes para endotelial mechanosensing 8. A atividade das células endoteliais e morfologia são afetadas pela velocidade de fluxo, direção e pulsatilidade. Além disso, células do músculo liso (SMC) migração pode ser afectada por Mecano-sinais de baixa velocidade de fluxo através do fluido intersticial 9, e pode também ser através da sinalização parácrina a partir de células endoteliais através da sua resposta ao fluxo e mecano-transdução de sinais de fluxo através de citocina liberar 10. A &quot;dose&quot; dependência de cisalhamento média, PI, e sinalização parácrina também podem ser interdependentes. Para este fim, a determinação da resposta vascular à célula de cisalhamento de fluidos com &quot;dosagem&quot; variada em cultura em monocamadaou co-cultura in vitro poderiam fornecer insights mecanicistas em remodelação vascular e melhorar a doença e previsão de tratamento. O sistema de fluxo utilizado neste experimento consiste em uma bomba de sangue, um fluxo de amortecimento reservatório de ar a montante, um medidor de vazão a jusante apenas utilizado durante a configuração experimental, uma cultura de células a jusante, de placas paralelas câmara de fluxo, e media reservatório. Controle de variáveis ​​de fluxo vascular, tais como vazão média, batidas por minuto, e PI pode ser alcançada através do controlo do caudal, frequência de pulso, e introdução de pressão de amortecimento. Bombas de sangue pulsátil estão disponíveis com deslocamento variável acidente vascular cerebral, acidente vascular cerebral na freqüência controlada, directamente relacionadas com a taxa média de fluxo volumétrico, e frequência de pulso. Introdução de um reservatório de ar no interior do circuito de escoamento permite amortecimento de pressão, reduzindo a oscilação do fluxo de magnitude. Media é um fluido incompressível, enquanto o ar dentro da câmara de amortecimento é compressível, permitindo que o excesso de pressão a partir da onda de fluxo para serabsorvida pela compressão de ar. O ar à relação da mídia permite o controle sobre a forma como ocorre muito amortecimento. Um costume cultura de célula de fluxo câmara de 75 mm de comprimento por 50 mm de largura foi criado a partir de acrílico. Fluxo entra através da porta de entrada, e expande-se através do colector de entrada, fornecendo um fluxo consistente entre os elementos da câmara de escoamento. Fluxo e estruturas semelhantes estão presentes na saída da câmara. As células são semeadas em lâminas de funcionalizados, e subsequentemente ligados à câmara de fluxo. Isto permite uma grande população, facilmente recuperados após o estudo. Experiências de co-cultura pode utilizar uma membrana porosa de policarbonato para eliminar o contacto célula-a-célula entre as culturas, permitindo o transporte de citocina / fluxo. Este sistema foi anteriormente usado para modelar um elevado caudal de PI e o seu efeito sobre a cultura monocamada endotelial e CE / SMC co-cultura 1, 10, para investigar a resposta celular à doença patologicamente elevada PI. Ao descrever o protocolo usado para modelar estes fluxo concondições, esperamos ajudar os outros para cálculo da contribuição de sinal para a célula de fluxo de resposta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide (70mm x 50mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Membrane</td>
			<td>Millipore Corp.</td>
			<td>HTTP09030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Gasket</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>RD 475464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (25 &#956;g/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type-I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damping Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>529552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Vinyl Carbonate Tubing</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>65066, 65063, 65062</td>
			<td>Various sizes may be required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Connections</td>
			<td>Nordson Medical</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Chamber</td>
			<td>Machined in-house</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri Dish</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-14007-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide Holder</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>WHE-900303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter</td>
			<td>Sonotec, GmbH</td>
			<td>Sonoflow co.55/060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 G Steel Cannula</td>
			<td>General Laboratory Supply</td>
			<td>S8365-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling

A doença vascular é uma causa comum de morte nos Estados Unidos. Aqui, apresentamos um método para examinar a contribuição da dinâmica de fluxo em direção patologias doença vascular. Artérias saudáveis ​​apresentam frequentemente enrijecimento da parede, cicatrizes, ou estenose parcial que pode afetar as taxas de fluxo de fluido, e a magnitude do fluxo pulsátil, ou índice de pulsatilidade. Replicação de várias condições de fluxo é o resultado de uma pressão de ajuste de fluxo a jusante da câmara de uma bomba de sangue de amortecimento. A introdução de ar dentro de um sistema fechado permite que o fluxo de um meio compressível para amortecer a pressão pulsátil da bomba, e, por conseguinte, variar o índice de pulsatilidade. O método descrito aqui é simplesmente reproduzidas, com entrada altamente controlável, e os resultados facilmente mensuráveis. Algumas limitações são recriação da forma de onda de pulso fisiológico complexo, o que só é aproximado pelo sistema. As células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos e são afectados pelo fluxo de sangue thrOugh da artéria. A componente dinâmica de fluxo de sangue é determinada através da saída da parede arterial e complacência cardíaca. Vascular célula mecano-transdução de dinâmica de fluxo pode desencadear a liberação de citocinas e cross-talk entre tipos celulares dentro da artéria. Co-cultura de células vasculares é uma interacção mais preciso célula-célula imagem de reflexão sobre a parede do vaso sanguíneo e a resposta vascular à sinalização mecânica. Contribuição de dinâmica de fluxo, incluindo a resposta celular aos componentes dinâmicos e médios (ou equilíbrio) de fluxo, é, por conseguinte, uma métrica importante na determinação da patologia da doença e da eficácia do tratamento. Através da introdução de um modelo de co-cultura in vitro e pressão de amortecimento a jusante da bomba de sangue que produz o débito cardíaco simulado, diversas patologias de doença arterial podem ser investigadas.

Manutenção de condições de fluxo é dependente de uma montagem correcta do circuito de fluxo (Figura 1). Tubulação de diâmetro é uma selecção importante na montagem, com diâmetros maiores diminuem a resistência do fluxo de queda de pressão e subsequente antes e depois da câmara de cultura. Para garantir a velocidade de pressão e fluxo pretendido, montar o sistema com medidor de fluxo antes de experimento com tubulação pretendido. Alinhamento de canal de vácuo câmara de cultura <strong...

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In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Este protocolo replica o fluxo sanguíneo fisiológico ou patológico in vitro para auxiliar na determinação da resposta celular em patologias de doenças. Com a introdução de uma pressão da câmara a jusante de uma bomba de sangue de amortecimento, o fluxo de sangue em toda a vasculatura pode ser recapitulada e que incide sobre uma monocamada de endotélio vascular ou de uma co-cultura mimética.

In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

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