Name: from constructs to crystals &#8211; towards structure determination of &#946;-barrel outer membrane proteins
Uploaded: 2016-07-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about From Constructs to Crystals Ã¢â‚¬â€œ Towards Structure Determination of ÃŽÂ²-barrel Outer Membrane Proteins at JoVE.com

We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).

1. الاستنساخ والتعبير ملاحظة: لتمكين الدراسات الهيكلية، كميات كافية من البروتين عالي النقاء يجب أن يكون مستعدا، وهذا يبدأ عادة مع الاستنساخ وoverexpression من البروتين الهدف β برميل الغشاء الخارجي (إم بي) في E. القولونية (الشكل 4)....

<ol>
	<li>Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins+in+bacteria+and+eukaryotes:+evolutionary+conservation+and+divergence.">Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).</li><li>Ricci, D. P., Silhavy, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bam+machine:+A+molecular+cooper.">The Bam machine: A molecular cooper.</a> Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).</li><li>Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Barrel+membrane+protein+assembly+by+the+Bam+complex.">beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex.</a> Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).</li><li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria.">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li><li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insight+into+the+biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins.">Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins.</a> Nature. 501, 385-390 (2013).</li><li>Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+YaeT:+conformational+flexibility+and+substrate+recognition.">Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition.</a> Structure. 16, 1873-1881 (2008).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+an+essential+component+of+the+outer+membrane+protein+assembly+machine.">Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine.</a> Science. 317, 961-964 (2007).</li><li>Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+energetic+basis+of+folded-protein+transport+by+the+FimD+usher.">Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher.</a> Nature. 496, 243-246 (2013).</li><li>Phan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+FimD+usher+bound+to+its+cognate+FimC-FimH+substrate.">Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate.</a> Nature. 474, 49-53 (2011).</li><li>van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+long-chain+fatty+acid+transporter+FadL.">Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL.</a> Science. 304, 1506-1509 (2004).</li><li>Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+biology+of+beta-barrel+membrane+proteins:+a+summary+of+recent+reports.">The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports.</a> Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).</li><li>Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TonB-dependent+transporters:+regulation,+structure,+and+function.">TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function.</a> Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).</li><li>Siburt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+transferrin+bound+iron:+protein-receptor+interactions+involved+in+iron+transport+in+N.+gonorrhoeae.">Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae.</a> Metallomics. 1, 249-255 (2009).</li><li>Cornelissen, C. N., Hollander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TonB-Dependent+Transporters+Expressed+by+Neisseria+gonorrhoeae.">TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae.</a> Front in Micro. 2 (117), (2011).</li><li>Dautin, N., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+secretion+in+gram-negative+bacteria+via+the+autotransporter+pathway.">Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway.</a> Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).</li><li>Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+V+secretion:+mechanism(s)+of+autotransport+through+the+bacterial+outer+membrane.">Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane.</a> Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).</li><li>Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G., Engelman, E. H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comprehensive Biophysics. 5, 139-163 (2011).</li><li>Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+colicin+I+receptor+bound+to+the+R-domain+of+colicin+Ia:+implications+for+protein+import.">Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import.</a> EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).</li><li>Yamashita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+Ail-mediated+adhesion+in+Yersinia+pestis.">Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis.</a> Structure. 19, 1672-1682 (2011).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).</li><li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors.">Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li><li>Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+major+envelope+protein+from+Escherichia+coli.+Regular+arrangement+on+the+peptidoglycan+and+unusual+dodecyl+sulfate+binding.">Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding.</a> J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).</li><li>Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+integral+membrane+proteins.">Crystallization of integral membrane proteins.</a> Curr Prot in Prot Science. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).</li><li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method.">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> JoVE. , e3383 (2012).</li><li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles.">Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).</li><li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , e4000 (2012).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , (2011).</li><li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+and+refolding+of+an+80-kDa+iron+transporter+from+the+outer+membrane+of+Escherichia+coli.">Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli.</a> Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).</li><li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-barrel+proteins+from+bacterial+outer+membranes:+structure,+function+and+refolding.">Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding.</a> Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).</li><li>Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+process+of+folding+proteins+into+membranes:+challenges+and+progress.">The process of folding proteins into membranes: challenges and progress.</a> Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).</li><li>Pautsch, A., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+outer+membrane+protein+A+transmembrane+domain.">Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain.</a> Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).</li><li>Cowan, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+OmpF+porin+in+a+tetragonal+crystal+form.">The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form.</a> Structure. 3, 1041-1050 (1995).</li><li>Ujwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+A+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating.">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> PNAS. 105, 17742-17747 (2008).</li><li>Robert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+factor+Omp85+recognizes+its+outer+membrane+protein+substrates+by+a+species-specific+C-terminal+motif.">Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif.</a> PLoS Bio. 4, e377 (2006).</li><li>Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+C-terminal+insertional+signal+in+Gram-negative+bacterial+outer+membrane+proteins+species-specific+or+not?.">Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?.</a> BMC Genomics. 13, 510 (2012).</li><li>Agah, S., Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+bicelles.">Crystallization of membrane proteins in bicelles.</a> Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).</li><li>Ujwal, R., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+bicelles.">Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles.</a> Methods. 55, 337-341 (2011).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies.">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).</li><li>Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+bacteriorhodopsin+at+1.55+A+resolution.">Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution.</a> J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).</li><li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel.">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482, 369-374 (2012).</li><li>White, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+agonist-bound+neurotensin+receptor.">Structure of the agonist-bound neurotensin receptor.</a> Nature. 490, 508-513 (2012).</li><li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor.">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li><li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex.">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li><li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+(SONICC).">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li></ol>

β برميل خطط إدارة تخدم أدوار أساسية في الجراثيم سلبية الغرام، الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء وهي أهداف هامة للالتحليل البنيوي التي تقدم ثروة من المعلومات حول الآليات الجزيئية الأساسية في الأغشية الخارجية لهذه العضيات منها. ومع ذلك، إنتاج عينة كافية لتحليل هيك...

β برميل خطط إدارة لا يمكن العثور عليها في الأغشية الخارجية للالميتوكوندريا، البلاستيدات الخضراء، والبكتيريا سالبة الجرام 1-3. في حين أنها تخدم أدوار مماثلة لالبروتينات α حلزونية، لديهم أضعاف مختلفة جدا تتكون من مجال β برميل جزءا لا يتجزأ من غشاء المركزي تتراوح 8-26 مكافحة موازية β-خيوط مع كل حبلا يجري يرتبط ارتباطا وثيقا لاثنين من فروع المجاورة (الشكلان 1 و 2). فروع الأولى والأخيرة في المجال β برميل ثم تتفاعل مع بعضها البعض، على وجه الحصر تقريبا بطريقة مضادة للالموازي (باستثناء VDAC الميتوكوندريا) ليغلق وختم المجال β برميل من الغشاء المحيط. جميع خطط إدارة β برميل لها حلقات الخلية متفاوتة تسلسل وطول والتي تلعب دورا مهما في التفاعلات يجند و / أو الاتصالات البروتين البروتين، مع هذه الحلقات يجري أحيانا كبيرة مثل 75 المخلفات، مثل الموجودة في نيسري ترانسفيرين ملزمة للمحترفينالبروتين ألف (TbpA) 4. β برميل خطط إدارة يمكن أن يكون أيضا ملحقات محيط بالجبلة N-الطرفية أو C-المحطة التي تخدم المجالات كما إضافية لغرض وظيفي البروتين (على سبيل المثال، باما 5-7، FimD 8،9، فضل 10). بينما العديد من أنواع خطط إدارة β برميل وجود 11، موصوفة اثنين من الأنواع الأكثر شيوعا أدناه كأمثلة لهذه أقل معرفة الميدان، (1) النقل تعتمد-طنب و (2) شاحنة نقل سيارات شاحنة. النقل طنب التي تعتمد على (على سبيل المثال، FEPA، TbpA، BtuB، سي آي آر، وما إلى ذلك) ضرورية لاستيراد المواد الغذائية وتحتوي على مجال المكونات N-المحطة تتكون من 150 ~ المخلفات التي تم العثور عليها مدسوس داخل 22 الذين تقطعت بهم السبل C-محطة β- نطاق برميل جزءا لا يتجزأ في الغشاء الخارجي 12 (الشكل 3). بينما يمنع هذا مجال المكونات الركيزة من يمر بحرية من خلال المجال برميل، الركيزة ملزمة يؤدي الى تغيير متعلق بتكوين ضمن المجال المكونات عشرفي يؤدي إلى مسام تشكيل (إما عن طريق قابس إعادة ترتيب أو الجزئي / طرد الكامل من المكونات) التي يمكن بعد ذلك تسهيل النقل الركيزة عبر الغشاء الخارجي في الجبلة المحيطية. النقل تعتمد-طنب ذات أهمية خاصة لبقاء بعض السلالات المسببة للأمراض من البكتيريا سالبة الجرام مثل النيسرية السحائية التي تطورت النقل المتخصصة التي اختطاف العناصر الغذائية مثل الحديد مباشرة من البروتينات المضيف الإنسان 4،13،14. شاحنة نقل سيارات شاحنة تنتمي إلى نوع V نظام إفراز سلبية الغرام البكتيريا وهي خطط إدارة بيتا برميل التي تتكون من مجال β برميل (عادة 12 جدائل كما هو الحال مع تهت وEspP) ومجال نقل الركاب التي إما يفرز أو قدمت في سطح الخلية 15،16 (الشكل 3). هذه خطط إدارة β برميل غالبا ما تكون أدوارا هامة في بقاء الخلية والفوعة مع المجال الركاب التي تخدم إما الأنزيم البروتيني، adhesin، و / أو EF الآخرينfector التي تتوسط المرضية. الطرق الهيكلية مثل البلورات بالأشعة السينية، مطيافية الرنين النووي المغناطيسي، والمجهر الإلكتروني (EM) تسمح لنا لتحديد نماذج لخطط إدارة المكاتب في قرار الذري والتي يمكن بدورها أن تستخدم لفك بالضبط كيفية عملها داخل الغشاء الخارجي. ومن ثم يمكن استخدام هذه المعلومات لا تقدر بثمن لمكافحة المخدرات وتطوير اللقاحات وجدت. على سبيل المثال، وجدت ترانسفيرين بروتين ملزمة ألف (TbpA) على سطح لبكتيريا ومطلوب لالمرضية لأنه يربط مباشرة ترانسفيرين الإنسان، ثم يستخرج واردات الحديد لبقائها. دون TbpA، النيسرية لا يمكن مسح الحديد من المضيف البشري ويتم تقديمها غير المسببة للأمراض. بعد أن تم حلها التركيب البلوري للترانسفيرين الإنسان بد أن TbpA 4، أصبح أكثر وضوحا كيف ترتبط اثنين من البروتينات، ما من مناطق TbpA بوساطة التفاعل، ما البقايا كانت مهمة لاستخراج الحديد من قبل TbpA، وكيف يمكن للمرء أن تطوير علاجات ضد النيسرية تستهدف TbpA. لذلك، نظرا لأهمية خطط إدارة المكاتب β برميل في البكتيريا سالبة الجرام من أجل البقاء والمرضية، وكذلك في الميتوكوندريا وظيفة بلاستيدات الخضراء، والحاجة للحصول على معلومات هيكلية إضافية حول هذه الفئة فريدة من بروتينات الغشاء والنظم التي تعمل بها ، يتم عرض بروتوكولات العامة مع الهدف العام للتعبير عن وتنقية خطط إدارة الهدف عند مستويات مرتفعة لتوصيف بالطرق الهيكلية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="804">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:175px;">Crystallization Robot</td>
			<td style="width:159px;">TTP Labtech, Art Robbins</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;">Any should work here, except for LCP crystallization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">PCR thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf, BioRad</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:175px;">Media Shaker</td>
			<td style="width:159px;">New Brunswick, Infors HT</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">UV-vis spectrometer</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">SDS-PAGE apparatus</td>
			<td style="width:159px;">BioRad</td>
			<td style="width:227px;">1645050, 1658005</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">SDS-PAGE and native gels</td>
			<td style="width:159px;">BioRad, Life Technologies</td>
			<td style="width:227px;">4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">AkTA Prime</td>
			<td style="width:159px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">AkTA Purifier</td>
			<td style="width:159px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">Centrifuge (low-medium speed)</td>
			<td style="width:159px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">Ultracentrifuge (high speed)</td>
			<td style="width:159px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">SS34 rotor</td>
			<td style="width:159px;">Sorvall</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Type 45 Ti rotor</td>
			<td style="width:159px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Type 70 Ti rotor</td>
			<td style="width:159px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:227px;">06 435C</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Emulsiflex</td>
			<td style="width:159px;">Avestin</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">D9652</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">LCP tools</td>
			<td style="width:159px;">Hamilton, TTP Labtech</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">VDX 24 well plates</td>
			<td style="width:159px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:227px;">HR3-172</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:175px;">Sandwich plates</td>
			<td style="width:159px;">Hampton Research, Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:227px;">HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:175px;">Grace Crystallization sheets</td>
			<td style="width:159px;">Grace Bio-Labs</td>
			<td style="width:227px;">875238</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">HiPrep S300 HR column</td>
			<td style="width:159px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:227px;">17-1167-01</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Q-Sepharose column</td>
			<td style="width:159px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:227px;">17-0510-01</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:175px;">Crystallization screens</td>
			<td style="width:159px;">Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:227px;">-</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:175px;">Gas-tight syringe (100 mL)</td>
			<td style="width:159px;">Hamilton&#160;</td>
			<td style="width:227px;">????</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from constructs to crystals &#8211; towards structure determination of &#946;-barrel outer membrane proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

YiuR هو طنب يعتمد نقل الحديد الذي هو هدف لقاح ضد المفترض يرسينيا بيستيس. وقد تم تحديد أصلا باستخدام الفحص ميكروأري. هنا، وترد الخطوات التي تم اتخاذها لتحديد بنية YiuR استخدام البلورات بالأشعة السينية (الشكل 9). لاستنساخ وتسلسل الحمض النووي ...

Watch this Scientific Journal Video about From Constructs to Crystals Ã¢â‚¬â€œ Towards Structure Determination of ÃŽÂ²-barrel Outer Membrane Proteins at JoVE.com

From Constructs to Crystals ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Towards Structure Determination of ÃƒÅ½Ã‚Â²-barrel Outer Membrane Proteins

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

من التركيبات لبلورات - نحو تحديد هيكل β برميل الخارجي بروتينات الغشاء

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Chemistry

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Cellular Processes

Cell Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

تحديد الحموضة في مرحلة غاز من Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Towards Biomimicking Wood: Fabricated Free-standing Films of Nanocellulose, Lignin, and a Synthetic Polycation

نحو Biomimicking الخشب: أفلام التجهيز الحرة الدائمة للNanocellulose، اللجنين، وPolycation الاصطناعية

Woody materials are comprised of plant cell walls that contain a layered secondary cell wall composed of structural polymers of polysaccharides and ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

كتلة الطيفية المداخل لدراسة بنية البروتين والتفاعلات في مساحيق المجففة بالتبريد

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Synthesis and Exfoliation of Discotic Zirconium Phosphates to Obtain Colloidal Liquid Crystals

التوليف وتقشير من Discotic الزركونيوم الفوسفات للحصول على بلورات الغروية السائل

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

حيود الأشعة السينية مسحوق في علوم الحفظ: نحو روتيني البنية البلورية تحديد التآكل المنتجات على كائنات التراث الفن

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

مستقرة للغاية، وظيفية مشعر النانوية والبوليمرات الحيوية من ألياف الخشب: نحو تقنية النانو المستدام

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

من جزيئات المواد: هندسة البلورات السائلة الأيونية الجديدة من خلال الربط هالوجين

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

تقنيات الرواية لمراقبة ديناميات الهيكلية من بلورات سائلة فوتوريسبونسيفي

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

غشاء يعيد البناء من حويصلات العملاقة في استجابة للتدرجات أيون الكالسيوم مترجمة

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...