Name: automated modular high throughput exopolysaccharide screening platform coupled with highly sensitive carbohydrate fingerprint analysis
Uploaded: 2016-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis at JoVE.com

We sincerely thank Thomas Howe and J&#246;rg Carsten for the programming and technical support with the liquid handling systems.

<ol>
	<li>Milani, J., Maleki, G., Valdez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2,+Hydrocolloids+in+Food+Industry.">Ch. 2, Hydrocolloids in Food Industry.</a> Food Industrial Processes - Methods and Equipment. 2, (2012).</li><li>Thibodeau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+the+skin+from+environmental+stresses+with+an+exopolysaccharide+formulation.">Protecting the skin from environmental stresses with an exopolysaccharide formulation.</a> Cosmet Toiletries. 120 (12), 81-90 (2005).</li><li>Prajapati, V. D., Jani, G. K., Zala, B. S., Khutliwala, T. 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Rheol. 23 (5), 52903 (2013).</li><li>Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Polysaccharides+as+Treatment+Agents+for+Wastewater.">Natural Polysaccharides as Treatment Agents for Wastewater.</a> Green Materials for Sustainable Water Remediation and Treatment. , 51-81 (2013).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+exopolysaccharide+screening+platform:+From+strain+cultivation+to+monosaccharide+composition+and+carbohydrate+fingerprinting+in+one+day.">High throughput exopolysaccharide screening platform: From strain cultivation to monosaccharide composition and carbohydrate fingerprinting in one day.</a> Carbohydr Polym. 122, 212-220 (2015).</li><li>Ortega-Morales, B. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+Bacterial+Extracellular+Polymeric+Substances?.">What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances?.</a> Microbial extracellular polymeric substances: characterization, structure and function. , 258 (1999).</li><li>R&#252;hmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+carbohydrate+analysis+via+liquid+chromatography+coupled+with+ultra+violet+and+electrospray+ionization+ion+trap+detection+in+96-well+format.">Fast carbohydrate analysis via liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection in 96-well format.</a> J. Chromatogr. A. 1350, 44-50 (2014).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Rilevamento polisaccaride con il metodo del fenolo-solforico-acido: diversi monosaccaridi mostrano diversi massimi di assorbimento e coefficienti di estinzione molare utilizzando questo metodo 9. Ciò si traduce in diversi massimi di assorbimento dei polimeri, che contengono molti zuccheri in quantità differenti. Le diverse lunghezze d&#39;onda massimi di assorbimento per 16 diversi polimeri disponibili in commercio sono riportati in Tabella 5. I polimeri sono stati sciolti (1 g / l) in DDH 2 O, agitazione (150 rpm) per una notte e misurata con l&#39;acido metodo fenolo-solforico . gum Diutan ha mostrato la massimi di assorbimento più basso a 470 nm e l&#39;acido ialuronico scleroglucano e il più alto a 484 nm. Sulla base di questi risultati 480 nm è stato scelto per questa piattaforma screening. L&#39;assorbanza relativa dei polimeri è stata calcolata sulla base della assorbanza ottenuto con 1 g / L di glucosio (impostato come 100%). I risultati più bassi sono stati ottenuti con scleroglucano e succinoglycan, entrambi con 92%. Questo è stato expette perché scleroglucano contiene solo glucosio e succinoglycan contiene glucosio e galattosio in un rapporto di 7: 1. Entrambi i polimeri commerciali hanno differenti perdite di essiccazione e contenuto di ceneri differenti, questo è il motivo per cui non è stato raggiunto il valore teorico di ~ 110%. Xylan ha mostrato la più alta assorbanza relativa con 311%. La ragione di questo è l&#39;elevato coefficiente di estinzione molare ottenuto da xilosio causa della forma furanosica più dominante. Ad un livello di 0,1 g / L di glucosio è stato raggiunto il limite di quantificazione, così come il limite di rilevamento ad una concentrazione &lt;0,05 g / L. Tuttavia, il limite di rivelazione per i ceppi positivi screening è superiore a 0,7 g / L e di conseguenza, il saggio ha mostrato una buona prestazione. Al fine di ottenere risultati affidabili, glucosio rimanente dopo gel-filtrazione è stata determinata con glucosio-test e questo valore è stato sottratto dal valore dal metodo fenolo-solforico-acido. Automatizzata di diluizione di glucosio-test: le prestazionidella determinazione del glucosio dopo coltivazione (diluizione 1: 100) è stata studiata. Per questo, 10 pl di surnatante sono stati trasferiti a 990 ml di DDH 2 O in un piatto pozzo profondo e mescolati con dieci volte aspirare e dispensare 180 microlitri di questa diluizione. Il secondo passo fondamentale è stata la corretta dispensazione di soli 5 un&#39;aliquota microlitri per la diluizione 1:10 dal glucosio-test dopo il gel-filtrazione. Per generare la diluizione 25 ml di DDH 2 O trasferiti con un microlitri punta 50 prima, successiva 20 ml di DDH 2 O e 5 microlitri gel filtrato sono stati aspirati insieme. Ciò garantisce una migliore rimozione della parte aliquota 5 microlitri dalla punta. Entrambi i passaggi di diluizione sono stati verificati con i vari standard di glucosio attraverso una glucosio-test. I risultati di due concentrazioni esemplari sono riportati nella Tabella 6 Il 1:. 100 diluizione per la determinazione del tenore di glucosio dopo coltivazione mostrato alta precisione per entrambi gli standard con un CV &amp; #60; 1,2%. Allo stesso tempo, la precisione per lo standard elevato era fino a 11.6 (errore%). Tuttavia, questo è trascurabile la determinazione del glucosio rappresenta solo il tenore di glucosio rimanente dopo coltivazione e di conseguenza, non è importante per la rilevazione del polimero. La diluizione 1:10 per il glucosio rimane dopo gel-filtrazione ha mostrato risultati molto affidabili, con un CV &lt;1,4% e una precisione &lt;errore 2,1%. Esame di evaporazione: La proiezione richiede 3,5 ore dal primo passo per la prima glucosio-test. Al fine di scoprire, se questo lasso di tempo ha un influsso su storage MTP non ridotti, 50 ml di standard di calibrazione di glucosio-test sono stati conservati con e senza copertura per 3,5 ore nel carosello robot. Nell&#39;intervallo di calibrazione (da 45 a 4,5 mg / L) la concentrazione del campione difficilmente aumentato. Un aumento - causata dall&#39;evaporazione - era al di sotto del 2,1% e solo per le due concentrazioni più basse (1,8 e 0,9 mg / L) ha raggiunto fino a 12,4% ( <strong&gt; Tabella 7). Gel-filtrazione: Elevate quantità di glucosio non metabolizzato disturbano la determinazione quantitativa di glucosio dal polimero idrolizzato. Pertanto, una fase gel-filtrazione è stato richiesto di rimuovere il glucosio rimane dopo la coltivazione. Inoltre, il gel-filtrazione purifica il polimero contenente supernatante da sali e composti monomerici carboidrati, diverse da quelle di glucosio, per minimizzare lo sfondo analitico nell&#39;analisi monomero. Nella fase gel filtrazione 35 ml di filtrato sono stati collocati al centro del pozzo. Per la convalida della robustezza del gel filtrazione nel sistema automatizzato, otto standard di calibrazione da 0,045 fino a 9 g / L di glucosio sono stati filtrati (n = 8). Il glucosio di ogni concentrazione è stata sempre ridotta di oltre il 95% del valore iniziale (Tabella 8). In tal modo, il gel-filtrazione mostrato ottimi risultati per diverse concentrazioni di glucosio. Inoltre, il rimanente glucosio dopo gel-filtration stata determinata anche con glucosio-test e sottratto dalla determinazione di fenolo-solforico-acido per ricevere la corretta quantità di glucosio equivalente per il polimero idrolizzato. Piruvato-assay: Prima di tutto, è stato esaminato se l&#39;neutralizzato e diluito (1,10) TFA-matrice dallo stadio di idrolisi interferisce con la reazione enzimatica. Pertanto, il dosaggio completo è stato eseguito due volte, una volta con e una volta senza matrice e ha mostrato risultati affidabili. Infine, il contenuto piruvato di 16 polimeri disponibili in commercio è stata misurata con successo ed è mostrata in Figura 3. E &#39;generalmente noto che su quei 16 polimeri solo succinoglycan e xanthan contengono naturalmente piruvato. Con la nostra piruvato-saggio di entrambi questi polimeri sono stati identificati correttamente. In scleroglucano, gomma welan e xylan piruvato è stata anche rilevata in quantità significative. In generale, la capacità del metodo è stato convalidato e la piruvato-assay showed un rendimento elevato. Essa ha dimostrato di essere in grado di rilevare piruvato in diversi polimeri dopo idrolisi. impronte digitali Carboidrati: Dopo aver eseguito tutti i moduli di analisi di screening automatizzato, potenziali produttori EPS sono stati selezionati per l&#39;analisi dei carboidrati delle impronte digitali. Per questo, sono stati applicati diversi criteri: 1) l&#39;osservazione positiva della viscosità dopo centrifugazione e / o dopo la filtrazione. 2) Precipitazione prima e dopo la filtrazione. fibre osservato e fiocchi sono stati valutati come positivi. 3) il valore equivalente di glucosio dal metodo fenolo-solforico-acido. Valori&gt; 700 mg / L sono stati classificati come positivi e valori tra 300 e 700 mg / l sono stati classificati come produttori EPS putativi. Quando due o tre criteri sono stati valutati come positivi, i ceppi sono stati selezionati per ulteriore analisi fingerprint carboidrati. I criteri possono essere personalizzati verso l&#39;obiettivo individuale dello screening EPS (ad esempio EPS a bassa viscosità). Il nostro approccio volto a trovare efficient EPS produttori. Durante la ricerca di ceppi che producono solo piccole quantità di EPS limite valutazione del glucosio equivalente deve essere ridotta. vantaggio tecnico e applicazioni future: Una caratteristica interessante di questo protocollo è il carattere modulare dei passi e dei diversi moduli di analisi. Essi possono essere combinati in vari modi, adattato alle esigenze individuali e nuovi moduli possono essere facilmente implementati. Inoltre, i moduli di analisi possono essere utilizzati separatamente, per esempio il modulo di idrolisi in combinazione con il modulo HT-PMP-derivatizzazione è in grado di eseguire una analisi della composizione monomerica da diverse soluzioni polimeriche (1 g / L) in formato a 96 pozzetti. Per i laboratori senza avere accesso ad un sistema di gestione dei liquidi lo screening completo può essere gestito manualmente senza alcuna modifica al regime di dispensazione. Tuttavia, utilizzando un sistema di gestione dei liquidi aumenta la velocità fino a 768 ceppi (invece di 192 ceppi se Screened manualmente) al giorno. Il protocollo descritto qui è capace di screening per generi diversi e quindi, per lo screening di grandi collezioni di deformazione per identificare nuovi produttori EPS e analizzare l&#39;impronta digitale di carboidrati in un unico approccio (Figura 4). Inoltre, uno screening mirato per polisaccaridi contenenti zuccheri rare come fucosio, acidi uronici o anche zuccheri sconosciuti può essere eseguito tramite la dettagliata analisi monosaccaride. Inoltre, diverse combinazioni di zucchero in rapporti definiti possono essere rilevati. In questo modo la semplice identificazione di varianti strutturalmente correlate di EPS già noti e di nuovi EPS.

esopolisaccaridi microbici (EPS) sono un gruppo strutturalmente molto diversi di polimeri che soddisfano diverse funzioni biologiche. Di solito sono costruite delle unità di ripetizione complesse, che si distinguono per i diversi tipi di monomeri (zuccheri, derivati ​​da zucchero, acidi zucchero), i legami tra questi monomeri e le loro sostituzioni. La diversità strutturale di polisaccaridi microbici conferisce caratteristiche piuttosto diverse per i membri di questa classe molecola, che permette la loro applicazione in diversi settori, come il cibo 1, cosmetici 2,3, la costruzione della chimica 4 o il trattamento delle acque 5. Per estendere ulteriormente il campo di applicazione di questi bio-based e tali polimeri sostenibili all&#39;identificazione di nuovi polisaccaridi microbici naturali e l&#39;ingegnerizzazione di varianti strutturali rappresenta approcci promettenti. In entrambi i casi, un metodo di screening rapido è richiesta per la scansione rapidamente un gran numero di ceppi microbici per theiR formazione polisaccaride, e di analizzare i loro prodotti. Pertanto, abbiamo recentemente sviluppato una piattaforma HT-proiezione 96 pozzetti per l&#39;analisi della produzione polisaccaride microbica da isolati naturali o varianti di deformazione ingegnerizzati che comprende l&#39;identificazione della composizione monomerica 6. Applicando questa piattaforma per un primo giro proiezione di ~ 500 isolati naturali ha permesso di identificare solo circa 10 al 20% dei ceppi isolati da poter produrre EPS (dati non mostrati). Ciò significa che il 80-90% dei ceppi analizzati non ha prodotto EPS alle condizioni applicate, e quindi un&#39;ulteriore analisi dettagliata delle impronte carboidrati non era necessario. Poiché questo altamente complesse di identificazione della composizione monomerica è un processo che richiede tempo, in particolare per l&#39;analisi dei dati, un metodo di pre-screening veloce per identificare i ceppi positivi nella produzione EPS, sarebbe aumentare drasticamente l&#39;efficienza. Inoltre, i reagenti,materiali di consumo e tempo di misura a UHPLC-UV-ESI-MS sarebbero ridotti. Inoltre, i diversi moduli analitici, se da un lato rendere il metodo altamente affidabile, sono invece complicando la movimentazione manuale di più di due piastre a 96 pozzetti in parallelo, e come tale limitare la potenzialità del metodo. Per queste ragioni, abbiamo deciso di sviluppare una piattaforma di screening automatizzato. Pertanto, abbiamo combinato il formato modulare della tecnica carboidrati impronte esistente con un metodo di rilevamento rapido completamente automatizzato del tenore totale di zucchero, sulla base della misurazione di assorbanza. Il metodo fenolo-solforico-acido rappresenta ancora il metodo di scelta per la rapida determinazione del contenuto totale di carboidrati di batteriche e vegetali polisaccaridi 7,8. Questo metodo è stato descritto da Dubois et al. 9 e adattato per diverse applicazioni e dimensioni del campione, anche per piccole dimensioni in piastre da 96 pozzetti 10,11. il pheMetodo nol-solforico-acido misura il contenuto totale di carboidrati di un valore, summating tutto monomerica, oligomerica e carboidrati polimerici dei campioni. Tenendo conto di tali aspetti, la scelta di un mezzo di coltura adatto è essenziale applicare questo metodo. mezzi complessi contenenti oligomerica o composti di carboidrati polimerici come estratto di lievito potrebbero portare a un contenuto di polimero modificato e, pertanto, devono rigorosamente essere evitati. Inoltre, elevate quantità di zuccheri sono utilizzati come C-source per la coltivazione dei ceppi. Alti livelli di carboidrati rimanenti dal processo di coltivazione potrebbero interferire negativamente con la misurazione del contenuto di EPS. Pertanto, si consiglia l&#39;uso di zuccheri definiti e puri. Nei nostri esperimenti abbiamo usato il glucosio per la coltivazione delle cellule. Il glucosio rimane dopo la coltivazione è stata ridotta mediante un gel-filtrazione e fissata mediante un glucosio-test. Infine, il glucosio equivalentes dei polisaccaridi sono stati calcolati sottraendo glucosio rimanente dopo il gel-filtrazione dal contenuto totale di carboidrati che era stata rilevata con il metodo del fenolo-solforico-acido. Gel-filtrazione e glucosio-test in combinazione con il metodo di fenolo-solforico-acido assicurano risultati affidabili e sono in grado di essere il primo sistema di rilevamento, completamente automatizzato. Due nuovi moduli analitici sono stati inclusi nella piattaforma di screening automatizzato per aumentare la quantità di informazioni dal sistema EPS rilevamento: la precipitazione e l&#39;osservazione di un aumento della viscosità. Molti diversi EPS - ad esempio succinoglycan, xantano e del colon acido 12 - sono segnalati per essere modificato con un non-carboidrati piruvato chetale su posizioni di zucchero C4 e C6. Tali chetali piruvato (proprio come esteri succinil mezzo e acidi uronici) contribuiscono alla natura polianionica e quindi, al prope fisicaproprietā del polimero interagendo con ponti catione bivalente 13. Al fine di identificare quei polimeri particolari determinazione del piruvato è stato stabilito come un altro modulo analitico aggiuntivo. Questo aumenta le informazioni sui sostituenti polisaccaridi e le loro potenziali proprietà macroscopiche. Combinando tutti i moduli consente l&#39;identificazione di diverse EPS e una determinazione rapida ed efficiente dei produttori EPS. Con questo approccio la piattaforma di screening potrebbe essere diviso in due parti principali (Figura 1). Entro la proiezione automatica (parte I) il flusso di lavoro avviene completamente automatizzato (Tabella 1) per preselezionare rapidamente le EPS ceppi produttori. L&#39;analisi carboidrati impronte digitali (parte II) determina quantitativamente la composizione monomerica del EPS prodotti dai ceppi preselezionati. In tal modo, l&#39;analisi dei dati è stato minimizzato per ottimizzare lo screening di grandi collezioni di deformazione. Questooffre la possibilità di analizzare 384 ceppi in una sola corsa di screening automatizzato e con due piste che sono possibili al giorno di 768 ceppi al giorno. Inoltre, l&#39;analisi dei carboidrati fingerprint fornisce una panoramica ancora più dettagliata di tutti i EPS identificati. Ciò consente l&#39;analisi diretta e l&#39;identificazione di solo leggermente diverse varianti EPS o completamente nuovi rispetto alle strutture chimiche già descritte di EPS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="887">
	<tbody>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:335px;">96 well deep well plate 2.0 mL (DWP)</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:143px;">780271</td>
			<td style="width:224px;">Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the&#160; glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990&#181;l of ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td style="width:185px;">Axygen</td>
			<td style="width:143px;">BF-400-S</td>
			<td style="width:224px;">Incubation film for pre- and main-culture DWP</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Aluminum Sealing Film</td>
			<td style="width:185px;">Axygen</td>
			<td style="width:143px;">PCR-AS-200</td>
			<td style="width:224px;">-80 &#176;C storage film for glycerol-stock plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">MCA96 Nested Disposable Tips 200 &#181;l</td>
			<td style="width:185px;">TECAN</td>
			<td style="width:143px;">30038619</td>
			<td style="width:224px;">Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">A/B glass-filter-plate 1&#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Pall Corporation</td>
			<td style="width:143px;">PN 8031</td>
			<td style="width:224px;">Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">96-well micro titer plate V-Bottom</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:143px;">651201</td>
			<td style="width:224px;">Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">96-well SpinColumn G-25</td>
			<td style="width:185px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:143px;">74-5612</td>
			<td style="width:224px;">Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">96-well micro titer plate V-Bottom</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:143px;">249944</td>
			<td style="width:224px;">Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Nested Disposable Tips SBS 50 &#181;l tips</td>
			<td style="width:185px;">TECAN</td>
			<td style="width:143px;">30038609</td>
			<td style="width:224px;">Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:335px;">Trough 250 ml</td>
			<td style="width:185px;">Axygen</td>
			<td style="width:143px;">Res-SW96-HP</td>
			<td style="width:224px;">Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetat buffer pH 5.6 (CP 5-7)</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:335px;">96-well micro titer plate F-Bottom (MTP)</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:143px;">655101</td>
			<td style="width:224px;">precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">96-well silicon cap mat&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Whatmann</td>
			<td style="width:143px;">7704-0105</td>
			<td style="width:224px;">Cover mat for MTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">200 &#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">70.760.002</td>
			<td style="width:224px;">For manually handling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">1000 &#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">70.762</td>
			<td style="width:224px;">For manually handling</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">96-well-PCR micro titer plate&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Brand</td>
			<td style="width:143px;">781350</td>
			<td style="width:224px;">Hydrolysis, PMP-derivatisation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">TPE (thermoplastic elastomer) cap mat&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Brand</td>
			<td style="width:143px;">781405</td>
			<td style="width:224px;">Hydrolysis, PMP-derivatisation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">Filter plate 0.2&#160;&#181;m Supor,&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Pall Corporation</td>
			<td style="width:143px;">PN 8019</td>
			<td style="width:224px;">Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Pipette Tips LHS 5-300 &#181;l</td>
			<td style="width:185px;">Brand</td>
			<td style="width:143px;">732150</td>
			<td style="width:224px;">Brand LHS system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">ABTS (2.2-azino&#8209;bis-(3&#8209;ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic&#160;acid)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A1888</td>
			<td style="width:224px;">Glucose-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Glucose oxidase&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">G2133</td>
			<td style="width:224px;">Glucose-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Horseradish peroxidase&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P6782</td>
			<td style="width:224px;">Glucose-assay, pyruvat-assay</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:335px;">DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4&#39;-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt)</td>
			<td style="width:185px;">Wako Chemicals GmbH</td>
			<td style="width:143px;">043-22351</td>
			<td style="width:224px;">Pyruvat-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Pyruvate oxidase&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4591</td>
			<td style="width:224px;">Pyruvat-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:185px;">Carl-Roth</td>
			<td style="width:143px;">P749.3</td>
			<td style="width:224px;">Pyruvat- and glucose-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:185px;">Carl-Roth</td>
			<td style="width:143px;">3904.3</td>
			<td style="width:224px;">Pyruvat- and glucose-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Thiamine pyrophosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">C8754</td>
			<td style="width:224px;">Pyruvat-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">31413</td>
			<td style="width:224px;">Pyruvat-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">20922.466</td>
			<td style="width:224px;">Precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Phenol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">20599.231</td>
			<td style="width:224px;">Phenol-sulfuric-acid method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:185px;">Carl-Roth</td>
			<td style="width:143px;">4623.4</td>
			<td style="width:224px;">Phenol-sulfuric-acid method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">T6508</td>
			<td style="width:224px;">Hydrolysis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Ammonium solution</td>
			<td style="width:185px;">Carl-Roth</td>
			<td style="width:143px;">P093.1</td>
			<td style="width:224px;">Hydrolysis, PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Ethanol absolut</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">20821.321</td>
			<td style="width:224px;">Hydrolysis, PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Phenol red&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:143px;">B21710</td>
			<td style="width:224px;">Hydrolysis, PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">M70800</td>
			<td style="width:224px;">PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Methanol LC-MS</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">83638.320</td>
			<td style="width:224px;">PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Acetonitril LC-MS</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">83040.320</td>
			<td style="width:224px;">PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">338826</td>
			<td style="width:224px;">PMP-derivatization,</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Ethanol absolut</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">20821.321</td>
			<td style="width:224px;">PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Methyl red&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:143px;">36667</td>
			<td style="width:224px;">pH-value</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Robotic liquid handling system&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Freedom EVO</td>
			<td style="width:224px;">Worktable setup in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid handling station LHS</td>
			<td>Brand</td>
			<td>709400</td>
			<td style="width:224px;">Worktable setup in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tip-Adapter&#160;</td>
			<td>Brand</td>
			<td>709434</td>
			<td style="width:224px;">Worktable setup in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid Ends MC 20-300&#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>709416</td>
			<td style="width:224px;">Worktable setup in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adapter 60mm</td>
			<td>Brand</td>
			<td>709430</td>
			<td style="width:224px;">Worktable setup in Figure 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated modular high throughput exopolysaccharide screening platform coupled with highly sensitive carbohydrate fingerprint analysis

Molti microrganismi sono in grado di produrre e secernere esopolisaccaridi (EPS), che hanno importanti implicazioni in campo medico, applicazioni alimentari o nella sostituzione delle sostanze chimiche petro-based. Descriviamo una piattaforma analitica essere automatizzato in un sistema di gestione dei liquidi che permette l&#39;analisi veloce e affidabile del tipo e la quantità di EPS prodotta da microrganismi. Esso consente all&#39;utente di identificare nuovi produttori esopolisaccaride microbici naturali e di analizzare l&#39;impronta digitale carboidrati dei corrispondenti polimeri entro un giorno in high throughput (HT). Utilizzando questa piattaforma, le collezioni di deformazione così come le biblioteche di varianti deformazione che potrebbero essere ottenuti in approcci di ingegneria possono essere sottoposti a screening. La piattaforma ha una configurazione modulare, che consente una separazione del protocollo in due parti principali. In primo luogo, vi è un sistema di screening automatizzato, che combina diversi moduli di rivelazione polisaccaride: un&#39;analisi semi-quantitativa di viscositformazione y attraverso una fase di centrifugazione, l&#39;analisi della formazione del polimero mediante precipitazione alcol e la determinazione del contenuto totale di carboidrati tramite una trasformazione fenolo-solforico-acido. Qui, è possibile allo schermo fino a 384 ceppi per ciclo. La seconda parte fornisce un&#39;analisi monosaccaride dettagliata per tutti i produttori EPS selezionati identificati nella prima parte combinando due moduli fondamentali: l&#39;analisi della composizione completa monomero tramite cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata con ultravioletti e rilevazione trappola ionica ionizzazione elettrospray ( UHPLC-UV-ESI-MS) e la determinazione del piruvato come sostituente polimero (presenza di piruvato chetale) tramite ossidazione enzimatica che è accoppiato ad una formazione di colore. Tutti i moduli di analisi di questa piattaforma di screening possono essere combinati in modi diversi e regolati alle esigenze individuali. Inoltre, possono essere gestiti manualmente o eseguiti con un sistema di gestione dei liquidi. In tal modo, il PLA di screeningTForm consente una grande flessibilità per identificare vari EPS.

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Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Automatizzata Modular High Throughput Screening esopolisaccaride piattaforma Accoppiato con altamente sensibile Analisi Carboidrati impronte digitali

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

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