Name: generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro
Uploaded: 2015-11-24T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro at JoVE.com

Эта работа финансируется за счет ERC Advanced следователь премии AMA (в DAT, ТБ) с вклада гранта проекта от Wellcome Trust в AMA, в EPSRC студенчества к PB-J и Эразма, Stichting др. Хендрик Мюллер Vaderlandsch Фон и Fundatie ван де Vrijvrouwe ван Renswoude те &#39;ы-Гаага, чтобы SCvdB. Мы хотим поблагодарить J. Бриско, С. Муньос-Descalzo, К. Шретер и Т. Родригес, для обсуждения и конструктивную критику, Хоакин де Наваскес для монтажа средней протокола и оба АК Hadjantonakis и С. Budjan для обмена протоколы своей лаборатории в относящиеся к окрашиванию целых монтажа эмбрионов. Более ранняя версия этой статьи была ранее размещена на сервере bioRxiv Препринт 29.

<ol>
	<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt,+Activin,+and+BMP+Signaling+Regulate+Distinct+Stages+in+the+Developmental+Pathway+from+Embryonic+Stem+Cells+to+Blood.">Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+Is+a+Critical+Specifier+of+Human+Primordial+Germ+Cell+Fate.">SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate.</a> Cell. 160, 1-16 (2015).</li><li>Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+developmental+marker+genes+to+define+temporal+and+spatial+patterns+of+differentiation+during+embryoid+body+formation.">Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation.</a> J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).</li><li>Eiraku, M., Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Koehler, K. R., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+mouse+embryonic+stem+cell+culture+for+generating+inner+ear+organoids.">3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids.</a> Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).</li><li>Lancaster, M. A., Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+P19+mouse+embryonal+carcinoma+cells+as+a+simple+in+vitro+model+to+study+the+molecular+regulations+of+mesoderm+formation+and+axial+elongation+morphogenesis.">Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis.</a> Genesis. 47 (2), 93-106 (2000).</li><li>Keller, R., Danilchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+expression,+pattern+and+timing+of+convergence+and+extension+during+gastrulation+of+Xenopus+laevis.">Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis.</a> Development. 103 (1), 193-209 (1988).</li><li>Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastocoelic+fluid+of+sea+urchin+embryo+induces+exogastrulation.">The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation.</a> J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).</li><li>Horstadius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanisms+of+Sea+Urchin+Development,+Studied+by+Operative+Methods.">The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods.</a> Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).</li><li>Holtfreter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+totale+Exogastrulation,+eine+Selbstabl&#246;sung+des+Ektoderms+vom+Entomesoderm.">Die totale Exogastrulation, eine Selbstabl&#246;sung des Ektoderms vom Entomesoderm.</a> Wilhelm Roux'Archiv f&#252;r Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).</li><li>van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+breaking,+germ+layer+specification+and+axial+organization+in+aggregates+of+mouse+ES+cells.">Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li><li>Eiraku, M., Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Turner, D. A., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+and+FGF+signaling+direct+the+specification+and+elongation+of+a+neural+axial+progenitor+in+ensembles+of+mouse+ES+cells.">Wnt/&#946;-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li><li>Faunes, F., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane-associated+&#946;-catenin/Oct4+complex+correlates+with+ground-state+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A membrane-associated &#946;-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells.</a> Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).</li><li>Kalmar, T., Lim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+Fluctuations+in+Nanog+Expression+Mediate+Cell+Fate+Decisions+in+Embryonic+Stem+Cells.">Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells.</a> PLoS Biol. 7 (7), e1000149 (2009).</li><li>Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Ru&#233;, P., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interplay+between+extracellular+signalling+and+the+dynamics+of+the+exit+from+pluripotency+drives+cell+fate+decisions+in+mouse+ES+cells.">An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells.</a> Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).</li><li>Turner, D. A., Ru&#233;, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brachyury+cooperates+with+Wnt/&#946;-Catenin+signalling+to+elicit+Primitive+Streak+like+behaviour+in+differentiating+mouse+ES+cells.">Brachyury cooperates with Wnt/&#946;-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells.</a> BMC Biol. 12 (1), 63 (2014).</li><li>Ying, Q. -. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Ying, Q. -. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture.">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).</li><li>Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -. K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Embryology of the Mouse. , 1-90 (2011).</li><li>Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Aggregates+of+Mouse+ES+Cells+that+Show+Symmetry+Breaking,+Polarisation+and+Emergent+Collective+Behaviour+in+vitro.">Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro.</a> bioRxiv. , (2014).</li><li>Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mesoderm+induction+and+its+specification+to+the+hemangioblast+during+embryonic+stem+cell+differentiation.">Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).</li><li>Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Glycogen+Synthase+Kinase+3+Inhibitors+Potentiate+Insulin+Activation+of+Glucose+Transport+and+Utilization+In+Vitro+and+In+Vivo.">Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).</li><li>Inman, G. J., Nicol&#225;s, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-beta+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+(ALK)+receptors+ALK4,+ALK5,+and+ALK7.">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).</li><li>Hao, J., Daleo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin,+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling,+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells.">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 3 (8), e2904 (2008).</li><li>Neely, M. D., Litt, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMH1,+a+highly+selective+small+molecule+BMP+inhibitor+promotes+neurogenesis+of+hiPSCs:+comparison+of+PAX6+and+SOX1+expression+during+neural+induction.">DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction.</a> ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12+Sox17+promotes+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+by+directly+regulating+extraembryonic+gene+expression+and+indirectly+antagonizing+self-renewal.">12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal.</a> Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).</li><li>Chambers, I., Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+and+differential+localization+of+lipid-modified+GFP-variant+fusions+in+embryonic+stem+cells+and+mice.">et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice.</a> Genesis. 44 (4), 202-218 (2006).</li><li>Serup, P., Gustavsen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+promoter+substitutions+generating+transcriptional+sentinels+of+diverse+signaling+pathways+in+embryonic+stem+cells+and+mice.">Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice.</a> Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).</li><li>Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPRT-deficient+(Lesch-Nyhan)+mouse+embryos+derived+from+germline+colonization+by+cultured+cells.">HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells.</a> Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II. , (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Описанная методика в этой рукописи эффективно и воспроизводимо создает агрегаты мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs), которые отображают организована нарушения симметрии и удлинения 19, сочетающая культуру висячей капли, описанный Marikawa др. 14 и EB формирования. Эти агрегаты перейти к разработке осевых удлинения, дополняя существующие методы для генерации передних органов с ЭС клеток, таких как оптические чашки 11 и коре головного мозга 13, и содержат клетки с идентичностей трех зародышевых листков, которые отображают процессы, аналогичные тем, которые во время гаструляции таких, как быстрое движение клеток 19,21. Это интересно порассуждать о природе случае нарушения симметрии, так как это происходит в отсутствие внешних паттерна тканей и зиготический асимметрия киев 19. Спонтанное образование зачаточном оси может возникнуть из уже существующих heterogeneities в стартовом культуры клеток, которые формируют основу для развития асимметрии. Действительно, популяции клеток, культивируемых в условиях ESLIF отображения смесь самообновлению и дифференциации клеток, относительные пропорции которых могут изменяться от одного агрегата к другому. Кроме того, предварительная работа в нашей лаборатории предполагает, что агрегаты из полностью плюрипотентных клеток населения показывают, задержка развития и дефекты в формировании паттерна, предлагая роль неоднородности в формировании организованной шаблон (Д. Тернер и А. Мартинес Ариас, в процессе подготовки). Стоит также учесть, что механизм реакции-диффузии может генерировать образец, с диффузией ингибитора от поверхности агрегата. Warmflash др. 41 полагают, что такой механизм может быть ответственным за разработку радиального асимметрии в прикрепленной культуре, что делает его возможным кандидатом на паттерна в трех измерениях. Во время Первол 48 ч период агрегации, клетки достигают состояния, аналогичную в постимплантационного эпибласта, в котором они компетентны отвечать на сигналы от вторичной среды 19,21,24. Как правило, протокол, описанный здесь, обеспечивает клетки с импульсом вторичной среды, которое содержит факторы (такие как агонисты Wnt / β-катенин), которые обеспечивают сигналы, достаточные для удлинения. Предыдущие способы культивирования, описанные Ланкастер и др. (С использованием ЭСК человека 13) и Eiraku др. (С mESCs 11) используется короткий период агрегации в низкой адгезии 96-луночные планшеты, прежде чем агрегированные клетки были переданы капель матригеля сотрудников, проводящих собирается культуру. Хотя время между агрегации и Матригель вставки отличалась между исследований, в обоих случаях, большое количество клеток были использованы для образования агрегатов (примерно 3,000-4,500 клеток). В отличие от этого, протокол, описанный здесь, использует 19 гораздо меньше клеток (примерно 400 клетокза совокупности), который был определен, чтобы быть абсолютно необходимым для процесса удлинения, нарушения симметрии и поляризации, которая наблюдается 19. Кроме того, эти удлиненные структуры могут быть созданы в гораздо более короткий период времени без встраивания в искусственных матриц: сравнить поколение определенных областей мозга с помощью Ланкастер и др (&gt; 20-30 дней) 13 и оптические чашки от Eiraku. и др. (~ 11 дней) 11 с 5 дней, необходимых для генерации поляризованных удлиненных структур. Одно из ограничений с помощью метода, описанного здесь культуры, однако, является то, что они могут быть культивированы только в течение примерно 5-6 дней после посева, пока их размер не делает их компетентным в соответствии с тяжести опускаются на дно лунок и заставить адгезию даже на не -покрытие пластиковой посуды. Дальнейшие эксперименты с использованием искусственных матриц, таких как те, которые упомянуты ранее, может позволить нам увеличить срокнаблюдение и экспериментирование, и работа на постоянной основе, чтобы определить влияние ограничения агрегаты таким образом. Еще одно ограничение этого метода является то, что для того, чтобы изменить среду без удаления агрегатов, небольшой объем среды должны быть оставлены в нижней части скважины. Последствия для химических генетики подходов необходимость рассмотреть этот разбавление и остаточных эффектов от предыдущего СМИ: в день 3 мкМ Чи импульса, 2,37 мкМ раствор на самом деле доставлен, и последующие изменения средних привести в перенесенных из 0,499 мкМ (72-96 ч) и 0,105 мкм (96-120 ч) между временных точках. Текущая работа не корректируется для разбавления и предполагается, что ежедневные изменения среднего позволит свести к минимуму остаточные эффекты. Есть ряд важных шагов в протоколе по обеспечению и внутри- и межрегиональных экспериментальную воспроизводимость. Во-первых, начиная культура mESCs должны быть в хорошем состоянии и не более СОnfluent и среднего всегда должен быть хорошего качества т.е.., свежий и хорошо перемешана (5А, В). Плохие условия культуры отрицательно влияют на агрегацию (рис 5Bi). Точная подсчет клеток для получения суспензии ~ 400 клеток / 40 мкл клеток имеет важное значение, так как более крупные агрегаты не самоорганизовываться и, скорее всего, образуют двойные агрегаты в каждой скважины (рис 5Bii) в то время как более мелкие агрегаты не могут прийти к правильным Плотность, где они способны реагировать на стимул (рис 5Biii). Ключевым шагом оптимизации стало включение второго PBS мыть, который удаляет загрязнений сыворотку из клеточной суспензии (шаг 2.6); это улучшило частоту агрегации и ускоренное развитие агрегатов примерно на 24 часов. Далее, обеспечивающие изменения средних применяются с достаточной силой, чтобы выбить любые агрегаты, которые имеют потенциал, чтобы присоединиться к поверхности скважины; Невыполнение этого RESULTS в &quot;сбой&quot; агрегатов (рис 5Biv). Кроме того, как упоминалось ранее (и ниже), очень важно, чтобы гарантировать, что агрегаты сохраняются в суспензионной культуре и предотвратить прилипание к любой поверхности. После того, как агрегаты придерживались, картина экспрессии генов и их удлинение потенциала нарушается. В этот метод является относительно простым, и в пределах компетенции людей с хорошим методов тканевых культур, большинство проблем, связанных с агрегацией может быть решена относительно быстро, если эти критические шаги выполняются; полный стол устранения неисправностей доступен (Таблица 1). После того, как освоили этот метод может быть использован для изучения осевого развития, нарушение симметрии и клетка-решения события. Более конкретно, эти агрегаты имеют потенциал для создания пулов клеток, которые до сих пор были недоступны в культуре, например, спинного мозга и мотог нейроны. Этические Примечание: Следует с должной осторожностью отметил, что перевод этого протокола на человека ES или IPS культуре клеток может привести экспериментатора близко к правовой основе четырнадцати дневного срока на исследования эмбриона человека, а именно генерации первичной полоски, как описано в оплодотворению и эмбриологии человека Закона о 2008 (Великобритания) 42. Поскольку Закон охватывает все живые человеческие эмбрионы, независимо от их манеры создания, культура человека gastruloids за пределами первобытного-полоски, как стадии будет за рамки лицензируемой исследований.

Изучение и понимание клеточной судьбы решений в раннем развитии млекопитающих могут воспользоваться культур эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), клоновых популяциях, полученных от бластоцисты, которые имеют возможность самостоятельно обновить и дифференцироваться во все типы клеток организма есть., они плюрипотентные 1,2. В то время как эти культуры были и продолжают быть полезными для понимания молекулярных основ клеточной судьбы решений, они не в состоянии воспроизвести некоторые из пространственных механизмов и глобальных поведения, которые создаются в эмбрионах во время гаструляции. В эмбриона, процесс переходит гаструляцией одну эпителиальный слой в трех различных зародышевых листков и наделяет эмбрион с открытой организации переднезаднем 3-5. Попытки повторять эти события Экс Vivo были основаны на генерации трехмерных агрегатов ЭСК, называемая эмбриоидных органов (ЭТ), и подвергая их тО условия дифференциации 6,7. Эти агрегаты могут быть уговорен дифференцироваться в различные типы клеток, некоторые из которых либо не могут быть получены или индуцированных с низкой эффективностью в прикрепленной культуре или не может быть произведены на всех;. Например, кровь и 8 примордиальных зародышевых клеток 9. Ограничение в использовании ЭТ однако, является то, что они не в состоянии отобразить морфогенетическое поведение, распределение зародышей слоя или осевой организации, которые являются основными характеристиками развивающегося эмбриона, в результате пространственного дезорганизации 6,10. В одном докладе, лечение ЭТ с Wnt приводит к слабому поляризации в экспрессии генов в некоторых агрегатов, но не ясно, морфогенез не наблюдается 7. В более поздних отчетов, ЭТ, которые культивировали в течение длительных периодов времени разработки передние структуры, такие как сетчатки, мозга и внутреннего уха сенсорных клеток, которые имитируют их аналоги эмбриональных но развиваться без контексте осевом organizatионная 11-13. В докладе Marikawa др. 14, время работы с агрегатами мыши Р19 эмбриона карциномы (ЭК) клеток, сформированных способом висячей капле, сообщает возникновение вытянутых структур мезодермального происхождения напоминающей удлинений, которые наблюдаются с exogastrulae в амфибии и эмбрионы морских ежей и Келлер экспланты 15-18. Как это не было отмечено с мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs), мы попытались воспроизвести поведение, наблюдаемое с P19 клетки EC использованием агрегатов mESCs 19, и мы сообщить условия культивирования, которые приводят к их симметрии и осевой удлинение. Важным отличием от работы с P19 клеток является то, что протокол агрегации, описанный здесь выполняется в 96-луночный планшет, аналогичной той, что описана Eiraku и др. 20, вместо того, чтобы висеть капель. Это изменение привело к увеличению эффективности с точки зрения совокупного восстановления, и в обоихвнутри и между экспериментальной воспроизводимости. Важно отметить, что поддержание агрегатов в отдельных скважинах гарантирует, что слияние между агрегатами (общий, когда объединение агрегатов из висячей капли) не происходит. Кроме того, ключевой особенностью протокола является 24 ч воздействия ингибитора GSK3 CHI99021 (Chi), мощного активатора сигнализации Wnt / β-катенин, после агрегации. Метод, описанный здесь служит основой для понимания процессов самоорганизации, осевой организации и зародышей спецификации слоя в культуре, что позволяет выводы быть сделаны в отношении осевого развития в естественных условиях 19,21. По этим причинам метод имеет потенциал, чтобы разрешить детальную механистический анализ процессов, которые могут быть трудно учиться в зародыше. Кроме того, потенциальное применение в генерации тканей и органов, которые не легко доступны в прикрепленной культуре в связи с отсутствием структурированного сотовой нише, таких какспинного мозга предшественников 21 и мотонейроны. Трехмерная совокупность культура предлагает физическую структуру и сигнализации среды, которые не могут быть достижимы с помощью традиционных средств, что приводит к новому подходу для вывода эмбриональных линий в пространственно организованной манере.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:116px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">31350-010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">25cm2 Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:116px;">Grenier Bio-one</td>
			<td style="width:87px;">690 175</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Benchtop Centrifuge</td>
			<td style="width:116px;">MSE</td>
			<td style="width:87px;">MSB020.CX1.5</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;width:235px;">BES Buffered Saline (BBS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">B2891</td>
			<td style="width:188px;">BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Centrifuge tubes (15 or 50ml)</td>
			<td style="width:116px;">Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td style="width:87px;">118271 or 227261</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:235px;">CHIR 99021 (Chi)</td>
			<td style="width:116px;">CSCR</td>
			<td style="width:87px;">n/a</td>
			<td style="width:188px;">Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Dissection Well (30mm Internal Diameter)</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:87px;">12678586</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:235px;">ESLIF</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:188px;">500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 &#181;L LIF (1000 units).</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Biosera</td>
			<td style="width:87px;">FB-1090/500</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Gelatin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">G1890-100G</td>
			<td style="width:188px;">Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Glasgow&#39;s Minimal Essential Medium (GMEM)</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">11710-035</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">35050-038</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">G5516</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Improved Neubauer Haemocytometer</td>
			<td style="width:116px;">Hawksley</td>
			<td style="width:87px;">AS1000</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant</td>
			<td style="width:116px;">CSCR</td>
			<td style="width:87px;">n/a</td>
			<td style="width:188px;">Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">n-Propyl-gallate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">02370</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:235px;">N2B27/NDiff 227</td>
			<td style="width:116px;">Stemcells, Inc.</td>
			<td style="width:87px;">SCS-SF-NB-02</td>
			<td style="width:188px;"><a href="http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff">http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:116px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">11140-035</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">P6148</td>
			<td style="width:188px;">Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">D8662</td>
			<td style="width:188px;">With Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">11360-039</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Sterile Reservoir</td>
			<td style="width:116px;">STARLAB</td>
			<td style="width:87px;">E2310-1010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate</td>
			<td style="width:116px;">Grenier Bio-one</td>
			<td style="width:87px;">650185</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">X100</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">25300-054</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro

Мы разработали протокол улучшения текущего эмбриоида тела (EB) культуру, которая позволяет изучение самоорганизации, нарушение симметрии, осевой удлинение и судьба клеток спецификации, используя агрегаты мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs) в суспензионной культуре. Небольшое число mESCs агрегируются в базальной среде в течение 48 ч в 96-луночных планшетах без тканевых культур, обработанных U-дном, после чего их компетенции отвечать на экспериментальных сигналов. После обработки, эти агрегаты начинают показывать признаки экспрессии гена поляризованного и постепенно изменять их морфологию от сферической массы клеток к удлиненному, хорошо организованной структуре, в отсутствие внешних сигналов асимметрии. Эти структуры способны не только отображать маркеры трех зародышевых листков, но и активно отображения гаструляции, как движения, о чем свидетельствует направленного смещение отдельных клеток из совокупности, которая в решающей происходит в одном регионе удлиненной конструкции. Это protocол дается подробное способ воспроизводимого формирования этих агрегатов, их стимуляции сигналов, таких как Wnt / β-катенин активации и ингибировании BMP и их анализа с помощью одного момента времени или покадровой флуоресцентной микроскопии. Кроме того, мы опишем изменения в текущих процедур окрашивания эмбрион весь монтажа мыши для иммуноцитохимического анализа специфических маркеров в течение установленного агрегатов. Изменения в морфологии, экспрессии генов и длиной агрегатов может быть количественно измерено, предоставление информации о том, как сигналы могут изменить осевые судьбы. Предполагается, что эта система может быть применена и к изучению ранних событий развития, таких как развитие осевого и организации, и в более широком смысле, процессы самоорганизации и клеточной принятия решений. Он также может обеспечить подходящую нишу для генерации типов клеток, присутствующих в эмбрионе, не достижимые при обычной культуры прикрепленных такие как спинного мозга и мотонейронов.

Появление клеток Сразу после посева и после агрегации Сразу же после посева, можно наблюдать присутствие отдельных клеток в каждую лунку 96-луночного планшета с использованием стандартного перевернутой тканевых культур микроскопом (Фиг.1В). В 8 часов обшивки, эти клетки будут начали спускаться на дно колодца силы тяжести и начали объединяться в дискретных кластеров (рис 1в). После 24 часов, то сливающиеся клетки завершили первичную агрегацию, и будет уплотнен в четко определенных, пока рваные агрегатов, где отдельные клетки нечеткие друг от друга (рис 1D). К концу второго дня (48 ч), агрегаты должны выглядеть &quot;чистой&quot;, приняв на все клетки внутри скважины (рис 1E); дно колодца может иметь некоторые клетки, которые были пролить от совокупности на данном этапе. Обеспечениечто агрегаты были объединены в N2B27, в это время точки, они должны быть сферическими, приблизительно 150-200 мкм в диаметре и свободно перемещаться внутри скважины (т.е.., не приклеена к нижней части лунки). Агрегация в других средствах массовой информации (т.е.., ESLIF или N2B27 с конкретными факторами) имеет потенциал, чтобы изменить как первоначальный совокупный морфологию и ответ на последующих стимулов (Тернер и др., В процессе подготовки). Представитель Морфологические изменения Добавление 24 ч импульса вторичного среде, содержащей Чи между 48 и 72 ч (1А, 5А) генерирует также определяется удлиненные агрегаты, которые показывают, поляризованный выражение в специфических маркеров зародышевых слоев 19,21. Сразу же после импульса Chi (72 ч), агрегаты начнут пролить клетки и начинают показывать свой ​​ответ на эти сигналы в направлении к концу этого дня (Фигура 3А). Эти ответыпроявляются изменения в экспрессии генов и морфологии, оба из которых зависит от обработки, что агрегаты получили после первоначального 48 ч агрегации период N2B27 (фиг.3В). Если только анализ конечной точки не требуется, оптимальное время для изображения агрегатов находится примерно 96-120 ч. В этот момент агрегаты будут разработаны четкие морфологии и экспрессию генов (фиг.3А), а их размеры и масса по-прежнему достаточно низкой, так что выброс среды от P200 пипетки достаточно, чтобы сместить любые, которые могут быть прикреплены. Непредотвращение крепление агрегата к колодцу отрицательно скажется на совокупный образование (рис 5Biv). Морфологии и экспрессии генов образец агрегатов могут быть изменены в зависимости от обработки. Представитель результаты длительных или импульсных режимах с одной или лечения или комбинации факторов приведены для ВМР4, Dorsomorphin H1 (BДепутат ингибитор рецепторов), ActivinA, SB43 (активин / Узловая ингибитор), оФРФ или PD03 (ингибитор МЕК) (3В). Совокупный изображений и количественный анализ изображения Агрегаты поддаются визуализации либо широкопольными микроскопии (в основном для покадровой съемки 19), или фиксированная и иммунологически для конфокальной микроскопии 19,21 (Рис.2). В настоящее время описание протокола и изображений выше, позволяет количественная информация, которые будут получены от этих агрегатах. После конфокальной или широким полем захвата изображения, длина и соответствующий экспрессии генов вдоль диаметра или позвоночника агрегата (сферической или удлиненной, соответственно; фиг.4А, В) может быть измерена. Эти анализы также непосредственно применимы к покадровой изображений, где можно получить информацию о скорости роста, размера и относительного удлинения агрегатов при различных условиях (рис 4 </strong&gt;). <img alt="фигура 1" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig1.jpg" /> Рисунок 1. Типичное время курс и в начале морфологии. (A) Типичное время-курс для агрегации экспериментов. Клетки объединяются в течение 48 ч в N2B27, содержащий суспензию ЭС клеток мыши (10 клеток / мкл) в 96-луночный планшет (P1, P2). (Б) немедленно после посева (T = ~ 5 мин), отдельные клетки могут быть видно в суспензии и начали образованию комков от 8h (C). (D) Через 24 часа клетки образовали единое агрегат в каждую лунку, которая приблизительно 100 мкм в диаметре. (Е) После агрегации 48 ч, совокупный Диаметр варьируется от 150-200 мкм. В этот момент, агрегирование среднего (N2B27) удаляется и вторичный среду добавляют либо для остальной части эксперимента (P1 в части А) или в течение 24 ч перед тем, как изменилось бПодтверждено, чтобы N2B27 (p2 в части А). Масштабная линейка представляет 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig2.jpg" /> Рисунок 2. Монтажные агрегаты на предметных стеклах. После того, как агрегаты были зафиксированы, иммунологически и помещают в среду монтажа, каждый агрегат пипеткой на предметное стекло микроскопа, как 17 мкл капли (A, B, B &#39;). Достаточно места остается между совокупным капель для предотвращения их слияния. Распорки сделаны с помощью двухсторонней ленты и помещены на каждом углу предметное стекло (A, A &#39;, B). Именно на них, что стакан покровное помещается. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> Рисунок 3. Влияние различных обработок на морфологию клеток агрегированных ES. После 2 дней в N2B27 ЭС клетки образовали агрегаты. Добавление специфических факторов либо как 1 день импульса (A) или непрерывно (B) может привести к изменению фенотипа агрегатов по отношению к полярности экспрессии генов, относительное удлинение потенциала, или их общую форму. Примеры в этом рисунке агрегаты, образованные из любой бюстгальтер :: GFP 30 (А) или Sox1 :: GFP 27 (В) ЭС клетки мыши вошедшие после 120 ч и обработанные, как указано. Чи: Чир 99021 31; SB43: СО четыреста тридцать одна тысяча пятьсот сорок две 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию го</a>это цифра. <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig4.jpg" /> Рисунок 4. Количественный анализ агрегатов. Типичный агрегат образуется из бюстгальтер :: GFP mESCs 25,30 Следующие 24 ч импульса Чи и отображаемого на 120 ч. Объединенного изображения яркого поля и GFP канала показан с сегментированным линии, обозначающей &#39;&#39; позвоночник из совокупности из точки А в точку Б (а), вдоль которого флуоресценции и длина агрегата может быть измерена (B). Длина (С) и &quot;округлость&quot; (Д) от 24 агрегатов в пределах одного эксперимента показаны. Форма дескрипторов, таких как округлость (D), округлости, периметра и площади могут быть измерены с помощью анализа изображений Cookbook плагин из анализа изображений программное обеспечение ФИДЖИ 35. Среднее обозначено горизонтальной линией на каждой временной точке;планки погрешностей показывают стандартное отклонение; бар шкала в (А) показывает, 200 мкм. Как есть тонкие различия между линиями клеток репортерных, ожидается, что после того, как импульс Чи, средняя максимальная длина и средний минимальный округлость агрегатов будет меняться. Между различными клеточными линиями, мы находим, что средняя максимальная длина может быть в пределах от ~ 400-800 мкм и средней минимальной округлости между 0,4 и 0,6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig5.jpg" /> Рисунок 5. Примеры неудач в образование агрегатов. Способность генерировать воспроизводимые агрегаты (а) зависит от критических факторов, таких как (BI) свежей и хорошо перемешанной вторичной среды, (BII, BIII) точность в подсчете начального Nхариус клеток и (BIV), обеспечивающих агрегаты не образуют прилипшие колонии т.е.., &#39;&#39; крах в поверхности скважины. Типичные примеры ошибок в образование агрегатов для каждого из указанных условий (В) показаны. Масштаб-бар, как указано; см Устранение неисправностей таблицу для деталей (таблица 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Таблица 1" src="/files/ftp_upload/53252/53252table1.jpg" /> Таблица 1. Руководство по устранению неполадок. Типичные ошибки, связанные с протоколом агрегации даны с предложениями, как к их решению. <img alt="Таблица 2" src="/files/ftp_upload/53252/53252table2.jpg" /> Таблица 2. Таблица испытанных клеточных линий для формирования AGGregates. Ряд клеточных линий 19,22,27,30,36-40 были охарактеризованы для формирования агрегатов и, хотя тонкие различия между клеточными линиями, как ожидается, и наблюдались, все вышеуказанные линии показывают аналогичную динамику в плане удлинения и морфологии. С точки зрения экспрессии генов, паттерн экспрессии специфичен для ген выражается, но в пределах каждой клеточной линии, паттерн экспрессии, как правило, соответствует в течение нескольких пассажей. Для согласованности, мы генерируем агрегаты из клеток, которые не превышали 15 проходов в культуре. <img alt="Таблица 3" src="/files/ftp_upload/53252/53252table3.jpg" /> Таблица 3. Список представительств антител, используемых в этих исследованиях. Выбор антител и факторов разбавления совокупного иммунной окраски.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro at JoVE.com

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

Генерация агрегатов эмбриональных стволовых клеток мыши, которые показывают нарушение симметрии, поляризация и возникающим коллективной Поведение<em&gt; In Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Генерация мышиный кардиостимулятор клеточных агрегатов на основе ES-Cell-программирования в комбинации с Myh6-промоутер-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Дифференциация нейронных эмбриональных стволовых клеток мыши в бессывороточной монослоя культуры

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Структурно-функциональные исследования в мышиных эмбриональных стволовых клеток Использование Рекомбиназа-опосредованного кассетный Обмен

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

В пробирке Рост Preantral фолликулов мыши под искусственной микрогравитации

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Поколение эшафот бесплатно, трехмерные инсулина выражая Pancreatoids от мыши поджелудочной железы прародителями в пробирке

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Картирование возобновительной пространственной организации клеток млекопитающих с использованием микрошаблонов и количественных изображений

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Оценка окислительного повреждения в первичной мыши глазной поверхностных клеток / стволовых клеток в ответ на ультрафиолет-C (UV-C) Ущерб

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Дифференцировка и характеристика нейронных предшественников и нейронов из эмбриональных стволовых клеток мышей

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...