Name: construction of cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (cnifers) for optical detection of neurotransmitters in vivo
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters CNiFERs for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo at JoVE.com

Wij danken B. Conklin (University of California, San Francisco) voor het verstrekken van de G qi5 en G qs5 cDNAs, A. Schweitzer voor hulp bij de elektronica, N. Taylor voor hulp bij het ​​screenen van klonen, Ian Glaaser en Robert Rifkin voor proeflezen en Olivier Griesbeck voor TN-XXL. Dit werk werd ondersteund door subsidies voor onderzoek door het Amerikaanse National Institute on Drug Abuse (NIDA) (DA029706; DA037170), het Nationaal Instituut voor Biomedische beeldvorming en Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) en de &quot;Neuroscience gerelateerd aan drugs &quot;training subsidie ​​door middel van NIDA (DA007315).

Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie zijn in overeenstemming met Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen, en zijn door de IACUCs aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï en de University of California, San Diego goedgekeurd. 1. Genereren GPCR tot expressie Lentivirus te transformeren HEK293 cellen <ol><li> Verkrijgen het cDNA voor een specifieke GPCR uit een commerciële bron, bijvoorbeeld cdna.org. Alternatief versterken het GPCR-gen uit een cDNA biblio...

<ol>
	<li>Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+in+vivo.+microdialysis+to+the+study+of+cholinergic+systems.">Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems.</a> Methods. 23, 21-39 (2001).</li><li>Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+subsecond+dopamine+release+with+fast-scan+cyclic+voltammetry+in+vivo.">Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo.</a> Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).</li><li>Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Chemical+Neurotransmission+with+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensors.">Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors.</a> ACS Chem Neurosci. , (2015).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+extrasynaptic+glutamate+dynamics+in+the+brain.">Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).</li><li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+fluorescent+probe+for+visualizing+glutamate+neurotransmission.">An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission.</a> Nat Methods. 10, 162-170 (2013).</li><li>Nguyen, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+biosensor+for+neurotransmitter+release+and+in+situ+receptor+activity.">An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity.</a> Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).</li><li>Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+reporters+reveal+in+vivo+dynamics+of+dopamine+and+norepinephrine+release+in+murine+cortex.">Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex.</a> Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. , e3998 (2012).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq&#945;+to+that+of+Gj&#945;.">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gq&#945; to that of Gj&#945;.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).</li><li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).</li><li>Yamauchi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+ligand-gated+ion+channel+receptors+with+genetically+encoded+Ca2++sensors.">Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors.</a> PLoS One. 6, e16519 (2011).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+during+action+initiation.">Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation.</a> Nature. 494, 238-242 (2013).</li></ol>

De oprichting van CNiFERs een innovatieve en unieke strategie voor het optisch meten van afgifte van neurotransmitters in de hersenen in vivo. CNiFERs zijn ideaal voor het meten extrasynaptic afgifte, dat wil zeggen, volume geleiding voor neurotransmitters. Moet voor elk CNiFER bezit de eigenschappen van de natieve GPCR, die een fysiologische optisch meten van de veranderingen in niveaus van neurotransmitters in de hersenen. Tot op heden zijn CNiFERs gemaakt voor het detecteren van acetylcholine (M1-CN...

Om volledig te begrijpen hoe neuronen communiceren in de hersenen, is het noodzakelijk om een werkwijze voor de afgifte van neurotransmitters in vivo te meten. Er zijn verschillende gevestigde technieken voor het meten neurotransmitters in vivo. Een algemeen gebruikte techniek is microdialyse, waarin een canule in de hersenen is geplaatst en een kleine hoeveelheid cerebrospinale vloeistof wordt verzameld en geanalyseerd met behulp van hoge-prestatie vloeistofchromatografie en elektrochemische detectie 1. Microdialyse een ruimtelijke resolutie in de orde van enkele diameter van de sonde, bijvoorbeeld ~ 0,5 mm voor een 200 urn diameter microprobe. De tijdsresolutie van deze techniek is echter traag vanwege sampling intervallen die duren meestal ~ 5 min of meer 1. Bovendien zijn analyses niet in real-time. Een andere techniek is snel scannen cyclische voltammetrie (FSCV), die een koolstofvezel sonde die in de hersenen wordt ingevoegd gebruikt. FSCV heeft uitstekende temporale resolutie (subsecond), hoge gevoeligheid (nanomolair), en ruimtelijke resolutie met een diameter van de sonde van 5 tot 30 pm. Echter, FSCV beperkt tot zenders die een karakteristiek oxidatie en reductie profiel met spanning te produceren op een koolstofatoom potentiometrische probe 2. Een derde techniek om neurotransmitters te meten is rechtstreeks via genetisch-gecodeerde neurotransmitter (NT) biosensoren 3. Bij deze methode wordt een fusie-eiwit gevormd dat een ligand bindend domein een zender gekoppeld met een fluorescentie-energieoverdracht (FRET) gebaseerde paar fluoroforen 4 of 5 gepermuteerde GFP bevat. In tegenstelling tot de vorige twee werkwijzen worden deze biosensoren genetisch gecodeerde en tot expressie gebracht op het oppervlak van een gastheercel, zoals een neuron, door de productie van transgene dieren of acuut bij gebruik van virale middelen om cellen te infecteren. Tot op heden zijn genetisch gecodeerd biosensoren is alleen ontwikkeld voor detecting glutamaat en GABA 3-5. Beperkingen met deze technieken de lage gevoeligheid, in het nM bereik, en het onvermogen om de detectie uit te breiden naar het grote aantal zenders, bijvoorbeeld klassieke neurotransmitters, neuropeptiden en neuromodulators, welk signaal door middel van G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR&#39;s) zijn. In feite, zijn er bijna 800 GPCRs in het menselijk genoom. Om deze tekortkomingen aan te pakken, hebben we een innovatief hulpmiddel om optisch maatregel vrijkomen van neurotransmitter die door middel van een GPCR signaleert ontwikkeld. CNiFERs (cell-based neurotransmitter fluorescente reporters gemanipuleerde) zijn klonale HEK293 cellen ontworpen om een specifieke GPCR dat, wanneer gestimuleerd, veroorzaakt een toename van intracellulaire [Ca2 +] die wordt gedetecteerd door een genetisch gecodeerde FRET gebaseerde Ca2 + sensor drukken, TN-XXL. Aldus CNiFERs transformeren neurotransmitter receptor binding in een verandering in fluorescentie, een directe en real-time optische read-out van de lokale neurotransmitter activiteit. Door gebruikmaking van de natuurlijke receptor voor een bepaalde neurotransmitter, CNiFERs behouden chemische specificiteit, affiniteit en temporele dynamiek van het endogeen tot expressie receptoren. Tot op heden zijn er drie soorten CNiFERs, één voor het detecteren van acetylcholine met de M1 receptor, één voor het detecteren van dopamine aangemaakt met de D2-receptor en één voor het detecteren van norepinefrine met de receptor α1a 6,7. De CNiFER technologie is gemakkelijk uitbreidbaar is, waardoor het vatbaar voor elk type GPCR. In dit artikel Jupiter beschrijven we en illustreren de werkwijze voor het ontwerpen, realiseren en testen in vivo CNiFERs voor elke toepassing.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1212">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&#160;</td>
			<td style="width:191px;">System Biosciences</td>
			<td style="width:429px;">CD510B-1</td>
			<td style="width:207px;">Cloning: for generating lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12x75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube</td>
			<td style="width:191px;">BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BD 40 um Falcon cell strainers</td>
			<td style="width:191px;">BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% Trypsin EDTA&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 Well Plate, flat bottom, clear&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well cell culture plates&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>CLS3997</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optilux black clear bottom&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3603</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flexstation pipet tips</td>
			<td style="width:191px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0911</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetylcholine Chloride&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">A2661</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Norepinephrine&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">A7256</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dopamine Hydrochloride&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">PHR1090</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GABA&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">A2129</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histamine&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">H7125</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamate&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">49621</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epinephrine&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">E4642</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Somatostatin&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">S1763</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5HT&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">H9523</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIP&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Alpha Diagnostics Inc.&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:429px;">SP-69627</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Orexin A</td>
			<td style="width:191px;">Alpha Diagnostics Inc.&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:429px;">12-p-01</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Substance P&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">S6883</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">A4036</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Melatonin&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">M5250C</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">Fluorescence Plate Reader &#38; software</td>
			<td style="width:191px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:429px;">Flexstation 3</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;DMEM (high glucose) with Glutamax&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:429px;">10569-010</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:429px;">10082-139</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;Pen/Strep&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:429px;">15140-122</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;Puromycin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:429px;">ant-pr-1</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;Fibronectin&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">F0895</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:387px;">CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box</td>
			<td style="width:191px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:429px;">D-3508)</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">cyanoacrylate glue&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Loctite</td>
			<td style="width:429px;">Loctite no. 495</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">plastic paraffin film&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:429px;">Parafilm&#174;</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NANOINJECTOR</td>
			<td style="width:191px;">Drummond</td>
			<td style="width:429px;">3-000-204</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GLASS ELECTRODES</td>
			<td style="width:191px;">Drummond</td>
			<td style="width:429px;">3-000-203G</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hand held drill</td>
			<td style="width:191px;">OSADA</td>
			<td style="width:429px;">Exl-M40</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Burrs for drill</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific</td>
			<td style="width:429px;">19007-05; 19007-07)</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">Sterilizing bath</td>
			<td style="width:191px;">FST</td>
			<td style="width:429px;">18000-45, Hot Bead Sterilizer</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:387px;">isoflurane chamber/mask</td>
			<td style="width:191px;">Highland Medical Equipment</td>
			<td style="width:429px;">564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">3D scope with arm</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">fiber optic light</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Betadine&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 % (v/v) isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Povidone-Iodine Prep Pads</td>
			<td style="width:191px;">dynarex</td>
			<td style="width:429px;">1108</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CYCLOSPORINE (INJECTION, USP)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 &#956;g per g rodent)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Akorn</td>
			<td style="width:429px;">NDC 17478-235-35</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgifoam</td>
			<td style="width:191px;">Ethicon</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Grip dental cement</td>
			<td style="width:191px;">Dentsply</td>
			<td style="width:429px;">#675571, 675572</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instant SuperGlue&#160;</td>
			<td style="width:191px;">NDindustries</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LOCTITE 4041</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">METABOND</td>
			<td style="width:191px;">C&#38;B</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">no. 0 cover glass</td>
			<td style="width:191px;">Fisher</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">stereotaxic frame&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Kopf</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Rectal probe and heating pad</td>
			<td style="width:191px;">FHC</td>
			<td style="width:429px;">40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">optical breadboard for imaging</td>
			<td style="width:191px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:191px;">Fisher</td>
			<td style="width:429px;">S55667</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kwik-Cast (Silicone elastomer)</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Suture&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Ethicon</td>
			<td style="width:429px;">18&#8217;&#8217;, 1667, 4-0</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">91500-09, 15018-10</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forcepts</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Student Halsted-Mosquito Hemostats</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">91308-12</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Small Vessel Cauterizer Kit</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">18000-00</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hot Bead Sterilizers</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">18000-45</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instrument Case with Silicone Mat</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">20311-21</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">20810-01</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:387px;">2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td style="width:429px;">FV1200 MPE</td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">Multiphoton laser</td>
			<td style="width:191px;">SpectraPhysics</td>
			<td style="width:429px;">Mai Tai DeepSee</td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">Green Laser</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td style="width:429px;">473 nm Laser</td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">xy translation base</td>
			<td style="width:191px;">Scientifica</td>
			<td style="width:429px;">MMBP</td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">FRET filter cube for YFP and CFP</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">25-X water immersion objective</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">air table</td>
			<td style="width:191px;">Newport</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">custom built light-tight cage</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (cnifers) for optical detection of neurotransmitters in vivo

Celgebaseerde neurotransmitter fluorescente reporters gemanipuleerd (CNiFERs) een nieuw instrument voor neurologen optisch detecteren van de afgifte van neurotransmitters in de hersenen in vivo. Een specifieke CNiFER werd uit een humane embryonale niercellijn die stabiel tot expressie brengt een specifieke G-eiwit gekoppelde receptor, die paren Gq / 11 G-eiwitten, en een op FRET gebaseerde Ca2 + -detector, TN-XXL. Activering van de receptor leidt tot een verhoging van het FRET signaal. CNiFERs hebben nM gevoeligheid en een temporele respons seconden omdat CNiFER kloon maakt gebruik van de natuurlijke receptor voor een bepaalde neurotransmitter, bijvoorbeeld D2R voor dopamine. CNiFERs worden direct geïmplanteerd in de hersenen, waardoor zij neurotransmitter afgifte zin met een ruimtelijke resolutie van minder dan honderd micrometer, waardoor ze ideaal volume transmissie in vivo meten. CNiFERs kan ook worden gebruikt om andere middelen te onderzoeken op mogelijke kruisreactiviteit in vivo. We hebben onlangs breidde de familie van CNiFERs om GPCR&#39;s omvatten die koppelen aan G i / o G-eiwitten. CNiFERs zijn beschikbaar voor het detecteren van acetylcholine (ACh), dopamine (DA) en norepinefrine (NE). Aangezien elke GPCR kan worden gebruikt om een ​​nieuwe maken CNiFER en dat er ongeveer 800 GPCRs in het menselijk genoom beschrijven we hier de algemene procedure voor het ontwerpen, realiseren en testen elk type CNiFER.

Een CNiFER is afgeleid van een humane embryonale niercellen (HEK293) cellen die is ontworpen om ten minste twee eiwitten stabiel tot expressie: een specifieke G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) en een genetisch gecodeerd [Ca2 +] opnemer, TN-XXL. TN-XXL ondergaat fluorescentie-energieoverdracht (FRET) tussen cyaan en geel fluorescerende eiwitten, eCFP en citroengeel, respectievelijk, in reactie op Ca2 + -ionen 6,15. Activering van GPCR&#39;s die endogeen <...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters CNiFERs for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo at JoVE.com

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters CNiFERs for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

We presenteren een protocol om op cellen gebaseerde neurotransmitter fluorescerende engineered reporters (CNiFERs) te creëren voor de optische detectie van volumetrische neurotransmitter release.

De bouw van het Cell gebaseerde neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) voor optische detectie van neurotransmitters<em&gt; In Vivo</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescerende Labeling Maakt Gerichte Extracellulair Single-unit Opnemen van geïdentificeerde neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Verdund-schedel Corticale Venster Techniek voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoom Pathogenese<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaan<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functioneel testen van Two netvliezen door<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring van Living zenuwuiteinde Labeling in haarfollikel Lanceolate Endings van de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optische coherentie tomografie: Beeldvorming muis retinale Ganglion cellen In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

Meten van In Vivo veranderingen in extracellulaire Neurotransmitters tijdens natuurlijk belonen van gedrag in vrouwelijke Syrische Hamsters

The ability to measure neurotransmitter release on a rapid time scale allows patterns of neurotransmission to be linked to specific behaviors or ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Controle van de circadiane klok genexpressie in de muis Suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...