Name: construction of cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (cnifers) for optical detection of neurotransmitters in vivo
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters CNiFERs for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo at JoVE.com

Nous remercions B. Conklin (Université de Californie, San Francisco) pour fournir les qi5 G et G QS5 cDNA, A. Schweitzer pour l&#39; assistance à l&#39;électronique, N. Taylor pour l&#39; aide au dépistage des clones, Ian Glaaser et Robert Rifkin pour la relecture et Olivier Griesbeck pour TN-XXL. Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche par le biais de l&#39;Institut national américain sur l&#39;abus des drogues (NIDA) (DA029706; DA037170), l&#39;Institut national d&#39;imagerie biomédicale et Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) et le &quot;Neuroscience liés à la drogue de subvention de formation des abus »par NIDA (DA007315).

Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude sont conformes à Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) des lignes directrices, et ont été approuvés par les IACUC à l&#39;École Icahn de médecine Mount Sinai et l&#39;Université de Californie, San Diego. 1. Générer GPCR exprimant lentivirus pour transformer des cellules HEK293 <ol><li> Obtenir l&#39;ADNc pour un GPCR spécifique à partir d&#39; une source commerciale, par exemple cdna.org. En variante, ampli...

<ol>
	<li>Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+in+vivo.+microdialysis+to+the+study+of+cholinergic+systems.">Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems.</a> Methods. 23, 21-39 (2001).</li><li>Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+subsecond+dopamine+release+with+fast-scan+cyclic+voltammetry+in+vivo.">Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo.</a> Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).</li><li>Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Chemical+Neurotransmission+with+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensors.">Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors.</a> ACS Chem Neurosci. , (2015).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+extrasynaptic+glutamate+dynamics+in+the+brain.">Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).</li><li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+fluorescent+probe+for+visualizing+glutamate+neurotransmission.">An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission.</a> Nat Methods. 10, 162-170 (2013).</li><li>Nguyen, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+biosensor+for+neurotransmitter+release+and+in+situ+receptor+activity.">An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity.</a> Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).</li><li>Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+reporters+reveal+in+vivo+dynamics+of+dopamine+and+norepinephrine+release+in+murine+cortex.">Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex.</a> Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. , e3998 (2012).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq&#945;+to+that+of+Gj&#945;.">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gq&#945; to that of Gj&#945;.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).</li><li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).</li><li>Yamauchi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+ligand-gated+ion+channel+receptors+with+genetically+encoded+Ca2++sensors.">Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors.</a> PLoS One. 6, e16519 (2011).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+during+action+initiation.">Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation.</a> Nature. 494, 238-242 (2013).</li></ol>

La création de CNiFERs offre une stratégie innovante et unique pour mesurer optiquement la libération de neurotransmetteurs dans le cerveau in vivo. CNiFERs sont parfaitement adaptés pour la mesure de libération extrasynaptique, à savoir, le volume de conduction, pour les neurotransmetteurs. Surtout, chacun CNiFER possède les propriétés du RCPG natif, fournissant une mesure optique physiologique des changements dans les niveaux de neurotransmetteurs dans le cerveau. À ce jour, CNiFERs ont ét...

Pour bien comprendre comment les neurones communiquent dans le cerveau, il est nécessaire d&#39;avoir une méthode pour mesurer la libération de neurotransmetteurs in vivo. Il existe plusieurs techniques bien établies pour la mesure in vivo des neurotransmetteurs. Une technique couramment utilisée est microdialyse, dans laquelle une canule est insérée dans le cerveau et un faible volume de liquide céphalorachidien est recueillie et analysée par chromatographie en phase liquide à haute performance et détection électrochimique 1. Microdialyse a une résolution spatiale de l&#39;ordre de quelques diamètres de la sonde, par exemple environ 0,5 mm pour un diamètre microsonde 200 um. La résolution temporelle de cette technique, cependant, est lente en raison des intervalles d&#39; échantillonnage qui durent généralement environ 5 minutes ou plus 1. En outre, les analyses ne sont pas faites en temps réel. Une autre technique consiste à balayage rapide voltamétrie cyclique (FSCV), qui utilise une sonde en fibre de carbone qui est insérée dans le cerveau. FSCV a une excellente températurerésolution orale (subsecond), haute sensibilité (nanomolaire), et la résolution spatiale avec des diamètres de sonde de 5 à 30 um. Cependant, FSCV est limitée aux émetteurs qui produisent une oxydation caractéristique et le profil de réduction avec la tension sur une sonde potentiométrique de carbone 2. Une troisième technique pour mesurer les neurotransmetteurs est directement à travers neurotransmetteurs génétiquement codés (NT) biocapteurs 3. Avec cette méthode, une protéine de fusion est créée qui contient un domaine de liaison de ligand pour un émetteur couplé à un transfert d&#39;énergie de résonance de fluorescence (FRET) paire à base de fluorophores 4 ou 5 permuté une GFP. Contrairement aux deux procédés précédents, ces biocapteurs sont génétiquement codées et exprimées sur la surface d&#39;une cellule hôte, telle qu&#39;un neurone, grâce à la production d&#39;animaux transgéniques ou aiguë avec l&#39;utilisation d&#39;agents viraux pour infecter des cellules. À ce jour, les biocapteurs génétiquement codés ont été seulement développé pour detecting de glutamate et de GABA 05/03. Limitations avec ces techniques ont été la faible sensibilité, dans la gamme nM, et l&#39;incapacité à élargir la détection du grand nombre d&#39;émetteurs, par exemple, les neurotransmetteurs classiques, neuropeptides et neuromodulateurs, qui signalent par G récepteurs couplés aux protéines (RCPG). En fait, il y a près de 800 GPCR dans le génome humain. Pour combler ces lacunes, nous avons développé un outil innovant pour mesurer optiquement la libération de tout neurotransmetteur qui signale par un GPCR. CNiFERs (fluorescente neurotransmetteur à base de cellules rapporteurs modifiés) sont des cellules HEK293 clonales modifiées pour exprimer un GPCR spécifique qui, lorsqu&#39;il est stimulé, provoque une augmentation intracellulaire [Ca 2+] , qui est détecté par un capteur à base de Ca 2+ FRET codé génétiquement, TN-XXL. Ainsi, CNiFERs transformer la liaison en un changement de fluorescence, en fournissant un r optique en temps réel directe et récepteur neurotransmetteuread-out de l&#39;activité des neurotransmetteurs local. En utilisant le récepteur natif pour un neurotransmetteur donné, CNiFERs conserver la spécificité chimique, l&#39; affinité et la dynamique temporelle des récepteurs endogènes exprimés. À ce jour, nous avons créé trois types de CNiFERs, un pour la détection de l&#39; acétylcholine en utilisant le récepteur M1, un pour la détection de la dopamine en utilisant le récepteur D2 et une pour la détection de la norépinéphrine à l&#39; aide du 6,7 récepteur α1a. La technologie CNiFER est facilement extensible et évolutive, ce qui rend prête à tout type de GPCR. Dans cet article JoVE, nous décrivons et illustrons la méthodologie pour concevoir, réaliser et test CNiFERs in vivo pour toute application.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1212">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&#160;</td>
			<td style="width:191px;">System Biosciences</td>
			<td style="width:429px;">CD510B-1</td>
			<td style="width:207px;">Cloning: for generating lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12x75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube</td>
			<td style="width:191px;">BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BD 40 um Falcon cell strainers</td>
			<td style="width:191px;">BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% Trypsin EDTA&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 Well Plate, flat bottom, clear&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well cell culture plates&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>CLS3997</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optilux black clear bottom&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3603</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flexstation pipet tips</td>
			<td style="width:191px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0911</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetylcholine Chloride&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">A2661</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Norepinephrine&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">A7256</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dopamine Hydrochloride&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">PHR1090</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GABA&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">A2129</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histamine&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">H7125</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamate&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">49621</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epinephrine&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">E4642</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Somatostatin&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">S1763</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5HT&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">H9523</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIP&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Alpha Diagnostics Inc.&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:429px;">SP-69627</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Orexin A</td>
			<td style="width:191px;">Alpha Diagnostics Inc.&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:429px;">12-p-01</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Substance P&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">S6883</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">A4036</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Melatonin&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">M5250C</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">Fluorescence Plate Reader &#38; software</td>
			<td style="width:191px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:429px;">Flexstation 3</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;DMEM (high glucose) with Glutamax&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:429px;">10569-010</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:429px;">10082-139</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;Pen/Strep&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:429px;">15140-122</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;Puromycin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:429px;">ant-pr-1</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;Fibronectin&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">F0895</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:387px;">CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box</td>
			<td style="width:191px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:429px;">D-3508)</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">cyanoacrylate glue&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Loctite</td>
			<td style="width:429px;">Loctite no. 495</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">plastic paraffin film&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:429px;">Parafilm&#174;</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NANOINJECTOR</td>
			<td style="width:191px;">Drummond</td>
			<td style="width:429px;">3-000-204</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GLASS ELECTRODES</td>
			<td style="width:191px;">Drummond</td>
			<td style="width:429px;">3-000-203G</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hand held drill</td>
			<td style="width:191px;">OSADA</td>
			<td style="width:429px;">Exl-M40</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Burrs for drill</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific</td>
			<td style="width:429px;">19007-05; 19007-07)</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">Sterilizing bath</td>
			<td style="width:191px;">FST</td>
			<td style="width:429px;">18000-45, Hot Bead Sterilizer</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:387px;">isoflurane chamber/mask</td>
			<td style="width:191px;">Highland Medical Equipment</td>
			<td style="width:429px;">564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">3D scope with arm</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">fiber optic light</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Betadine&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 % (v/v) isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Povidone-Iodine Prep Pads</td>
			<td style="width:191px;">dynarex</td>
			<td style="width:429px;">1108</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CYCLOSPORINE (INJECTION, USP)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 &#956;g per g rodent)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Akorn</td>
			<td style="width:429px;">NDC 17478-235-35</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgifoam</td>
			<td style="width:191px;">Ethicon</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Grip dental cement</td>
			<td style="width:191px;">Dentsply</td>
			<td style="width:429px;">#675571, 675572</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instant SuperGlue&#160;</td>
			<td style="width:191px;">NDindustries</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LOCTITE 4041</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">METABOND</td>
			<td style="width:191px;">C&#38;B</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">no. 0 cover glass</td>
			<td style="width:191px;">Fisher</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">stereotaxic frame&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Kopf</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Rectal probe and heating pad</td>
			<td style="width:191px;">FHC</td>
			<td style="width:429px;">40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">optical breadboard for imaging</td>
			<td style="width:191px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:191px;">Fisher</td>
			<td style="width:429px;">S55667</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kwik-Cast (Silicone elastomer)</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Suture&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Ethicon</td>
			<td style="width:429px;">18&#8217;&#8217;, 1667, 4-0</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">91500-09, 15018-10</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forcepts</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Student Halsted-Mosquito Hemostats</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">91308-12</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Small Vessel Cauterizer Kit</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">18000-00</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hot Bead Sterilizers</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">18000-45</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instrument Case with Silicone Mat</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">20311-21</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">20810-01</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:387px;">2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td style="width:429px;">FV1200 MPE</td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">Multiphoton laser</td>
			<td style="width:191px;">SpectraPhysics</td>
			<td style="width:429px;">Mai Tai DeepSee</td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">Green Laser</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td style="width:429px;">473 nm Laser</td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">xy translation base</td>
			<td style="width:191px;">Scientifica</td>
			<td style="width:429px;">MMBP</td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">FRET filter cube for YFP and CFP</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">25-X water immersion objective</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">air table</td>
			<td style="width:191px;">Newport</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">custom built light-tight cage</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (cnifers) for optical detection of neurotransmitters in vivo

Reporters base de cellules fluorescentes neurotransmetteur d&#39; ingénierie (CNiFERs) fournissent un nouvel outil pour les neuroscientifiques pour détecter optiquement la libération de neurotransmetteurs dans le cerveau in vivo. Un CNiFER spécifique est créé à partir d&#39; une cellule de rein embryonnaire humain qui exprime de manière stable un récepteur spécifique G couplé à la protéine, qui couple à G q / 11 protéines G, et un Ca 2+ -detector à base de FRET, TN-XXL. L&#39;activation du récepteur conduit à une augmentation du signal FRET. CNiFERs ont une sensibilité nM et une réponse temporelle de secondes parce qu&#39;un clone CNiFER utilise le récepteur natif pour un neurotransmetteur particulier, par exemple, D2R pour la dopamine. CNiFERs sont directement implantés dans le cerveau, ce qui leur permet de détecter la libération des neurotransmetteurs avec une résolution spatiale inférieure à cent um, ce qui les rend idéales pour mesurer la transmission de volume in vivo. CNiFERs peut également être utilisé pour dépister d&#39; autres médicaments pour la réactivité croisée potentielle dans vivo. Nous avons récemment élargi la famille de CNiFERs pour inclure GPCR ce couple à G i / o protéines G. CNiFERs sont disponibles pour la détection de l&#39;acétylcholine (Ach), la dopamine (DA) et la norepinephrine (NE). Étant donné que toute GPCR peut être utilisé pour créer un roman CNiFER et qu&#39;il ya environ 800 GPCR dans le génome humain, nous décrivons ici la procédure générale pour concevoir, réaliser et tester tout type de CNiFER.

Un CNiFER est dérivé d&#39;un rein embryonnaire (HEK293) cellule humaine qui est modifiée pour exprimer de façon stable au moins deux protéines: une protéine G spécifique des récepteurs couplés (GPCR) et une [Ca2 +] capteur codé génétiquement, TN-TTG. TN-XXL subit un transfert de résonance de fluorescence d&#39;énergie (FRET) entre cyan et jaune fluorescent protéines, ECFP et Citrine, respectivement, en réponse à des ions Ca 2+ 6,15. L&#3...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters CNiFERs for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo at JoVE.com

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters CNiFERs for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Nous présentons un protocole pour créer journalistes neurotransmetteur fluorescents à base de cellules modifiées (CNiFERs) pour la détection optique de la libération de neurotransmetteurs volumétrique.

La construction de base de cellules fluorescentes neurotransmetteur Engineered Reporters (CNiFERs) pour la détection optique des neurotransmetteurs<em&gt; In Vivo</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recherche

Neurosciences

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Diluée-skull Technique fenêtre corticale pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Tomographie par cohérence optique d&#39;imagerie

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Détection du génome et des transcriptions d&#39;un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L&#39;hybridation combinée avec immunocoloration

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modélisation astrocytome pathogenèse<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; Utilisation corticale astrocytes ou cellules souches neurales à partir de, souris génétiquement modifiées conditionnelle

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultané<em&gt; Ex vivo</em&gt; Tests fonctionnels de deux rétines par<em&gt; In vivo</em&gt; Système Électrorétinogramme

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Surveillance optique de Living Nerve Terminal Marquer follicule pileux lancéolées Endings du<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris oreille peau

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

Mesurer les variations In Vivo des neurotransmetteurs extracellulaires pendant naturellement récompenser les comportements chez les femelles Hamsters syriens

The ability to measure neurotransmitter release on a rapid time scale allows patterns of neurotransmission to be linked to specific behaviors or ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Suivi de l’Expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de Reporters de Fluorescence

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...