Name: construction of cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (cnifers) for optical detection of neurotransmitters in vivo
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters CNiFERs for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo at JoVE.com

私たちは、校正のためのイアンGlaaserとロバート・リフキン、クローンのスクリーニングの支援のために、電子機器の支援のためのG qi5とG QS5のcDNA、A.シュヴァイツァーを提供するためのN.テイラーB.コンクリン（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）を感謝します、およびTN-XXLのためのオリビエ​​Griesbeck。 （; DA037170 DA029706）、医学および生物工学研究所（NIBIB）（EB003832）、ホフマン・ラ・ロシュ（88610A）と「神経科学この作品は、薬物乱用に関する米国国立研究所（NIDA）を通じて研究助成金によってサポートされていましたNIDA（DA007315）を通じて虐待」訓練助成金の薬に関連します。

本研究で実行されるすべての動物の手順は、制度的動物実験委員会（IACUC）のガイドラインに従っていると、マウントサイナイ医科大学とカリフォルニア大学サンディ​​エゴ校のIACUCsによって承認されています。 1. HEK293細胞を形質転換するためのレンチウイルスのGPCRを発現生成<ol><li>商業的供給源、 例えば 、cdna.orgから特定 ​​のGPCRのcDNAを取得します。あるいは、PCRを用?...

<ol>
	<li>Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+in+vivo.+microdialysis+to+the+study+of+cholinergic+systems.">Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems.</a> Methods. 23, 21-39 (2001).</li><li>Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+subsecond+dopamine+release+with+fast-scan+cyclic+voltammetry+in+vivo.">Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo.</a> Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).</li><li>Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Chemical+Neurotransmission+with+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensors.">Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors.</a> ACS Chem Neurosci. , (2015).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+extrasynaptic+glutamate+dynamics+in+the+brain.">Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).</li><li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+fluorescent+probe+for+visualizing+glutamate+neurotransmission.">An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission.</a> Nat Methods. 10, 162-170 (2013).</li><li>Nguyen, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+biosensor+for+neurotransmitter+release+and+in+situ+receptor+activity.">An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity.</a> Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).</li><li>Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+reporters+reveal+in+vivo+dynamics+of+dopamine+and+norepinephrine+release+in+murine+cortex.">Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex.</a> Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. , e3998 (2012).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq&#945;+to+that+of+Gj&#945;.">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gq&#945; to that of Gj&#945;.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).</li><li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).</li><li>Yamauchi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+ligand-gated+ion+channel+receptors+with+genetically+encoded+Ca2++sensors.">Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors.</a> PLoS One. 6, e16519 (2011).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+during+action+initiation.">Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation.</a> Nature. 494, 238-242 (2013).</li></ol>

CNiFERsの作成 ​​は、光学的にin vivoでの脳内の神経伝達物質の放出を測定するための革新的でユニークな戦略を提供します。 CNiFERsは、理想的には、神経伝達物質、すなわちシナプスリリース、体積伝導を測定するのに適しています。重要なことには、各CNiFERは、脳内の神経伝達物質のレベルの変化の生理学的な光学的測定を提供する、天然のGPCRの特性を有します。現在までに...

完全ニューロンが脳内でどのように通信するかを理解するためには、 生体内での神経伝達物質の放出を測定するための方法が必要です。 生体内で神経伝達物質を測定するためのいくつかのよく確立された技術があります。 1つの一般的に用いられる技術は、カニューレが脳に挿入され、脳脊髄液の少量を採取し、高速液体クロマトグラフィーおよび電気化学的検出1を使用して分析された微小透析です。微小透析は、直径200μmのマイクロプローブのための〜0.5ミリメートル、 例えば 、プローブのいくつかの直径のオーダーの空間分解能を持っています。この技術の時間分解能は、しかし、一般的に約5分または1より長く続くサンプリング間隔に遅いです。さらに、分析はリアルタイムで行われていません。別の技術は、脳に挿入されたカーボンファイバープローブを使用して、高速走査サイクリックボルタンメトリー（FSCV）、です。 FSCVは、優れた温度を持っています経口解像度（サブ秒）、高感度（ナノモル）、および5〜30μmのプローブ径の空間分解能。しかし、FSCVカーボン電位差プローブ2の電圧との特性を酸化還元プロファイルを生成する送信機に限定されます。 神経伝達物質を測定するための第3の技術は、遺伝的にコードされた神経伝達物質（NT）バイオセンサ3を介して直接です。この方法で、融合タンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）フルオロフォア4のベースペアまたは順列GFP 5に接続された送信機のリガンド結合ドメインを含むように作成されます。前の2つの方法とは異なり、これらのバイオセンサーは、遺伝的にコードされ、トランスジェニック動物の産生を介して、または急性の細胞に感染するウイルス剤の使用と、そのようなニューロンとして、宿主細胞の表面に発現しました。現在までに、遺伝的にコードされたバイオセンサーは検知情報のために開発されていますグラムグルタミン酸やGABA 3-5。これらの技術に関する制限事項は、nM範囲の低感度、およびGタンパク質共役受容体（GPCR）を介してシグナル例えば送信機、古典的な神経伝達物質、神経ペプチドおよび神経修飾物質、多数のに検出を拡張することができないことでした。実際には、ヒトゲノム中に約800のGPCRがあります。 これらの不足に対処するために、我々は、GPCRを介して信号の任意の神経伝達物質の光学的に測定するリリースに革新的なツールを開発しました。 CNiFERs（セル・ベースの神経伝達物質の蛍光が記者を設計し）が刺激され、特定のGPCRを発現するように操作クローンHEK293細胞であり、遺伝的にコードされたFRETベースのCa 2+センサで検出された細胞内の増加の[Ca 2+]をトリガーTN-XXL。したがって、CNiFERsは、直接、リアルタイムの光Rを提供する、蛍光の変化に結合神経伝達物質受容体を変換します地元の神経伝達物質活性のEADアウト。指定された神経伝達物質のための天然受容体を利用することにより、CNiFERsは化学的特異性、親和性および内因的に発現される受容体の時間的なダイナミクスを保持している。これまでに、我々はドーパミンを検出するためのCNiFERs、M1受容体を使用してアセチルコリンを検出するための1つの、1の3種類を作成しましたD2受容体を使用して、α1A受容体6,7を使用して、ノルエピネフリンを検出するための1。 CNiFER技術は、GPCRのいずれかのタイプにそれが影響を受けやすい作り、容易に拡張可能かつスケーラブルです。このJoveの記事では、我々は説明し、任意のアプリケーションのためのin vivoでの CNiFERs で 、設計を実現するための方法論、およびテストを説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1212">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&#160;</td>
			<td style="width:191px;">System Biosciences</td>
			<td style="width:429px;">CD510B-1</td>
			<td style="width:207px;">Cloning: for generating lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12x75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube</td>
			<td style="width:191px;">BD Biosciences</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BD 40 um Falcon cell strainers</td>
			<td style="width:191px;">BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% Trypsin EDTA&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 Well Plate, flat bottom, clear&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well cell culture plates&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>CLS3997</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optilux black clear bottom&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3603</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flexstation pipet tips</td>
			<td style="width:191px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0911</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetylcholine Chloride&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">A2661</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Norepinephrine&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">A7256</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dopamine Hydrochloride&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">PHR1090</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GABA&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">A2129</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histamine&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">H7125</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamate&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">49621</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epinephrine&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">E4642</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Somatostatin&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">S1763</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5HT&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">H9523</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIP&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Alpha Diagnostics Inc.&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:429px;">SP-69627</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Orexin A</td>
			<td style="width:191px;">Alpha Diagnostics Inc.&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:429px;">12-p-01</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Substance P&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">S6883</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">A4036</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Melatonin&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">M5250C</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">Fluorescence Plate Reader &#38; software</td>
			<td style="width:191px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:429px;">Flexstation 3</td>
			<td>Flexstation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;DMEM (high glucose) with Glutamax&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:429px;">10569-010</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:429px;">10082-139</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;Pen/Strep&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:429px;">15140-122</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;Puromycin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:429px;">ant-pr-1</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">&#160;Fibronectin&#160;</td>
			<td style="width:191px;">SimgaAldrich</td>
			<td style="width:429px;">F0895</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:387px;">CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box</td>
			<td style="width:191px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:429px;">D-3508)</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">cyanoacrylate glue&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Loctite</td>
			<td style="width:429px;">Loctite no. 495</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">plastic paraffin film&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:429px;">Parafilm&#174;</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NANOINJECTOR</td>
			<td style="width:191px;">Drummond</td>
			<td style="width:429px;">3-000-204</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GLASS ELECTRODES</td>
			<td style="width:191px;">Drummond</td>
			<td style="width:429px;">3-000-203G</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hand held drill</td>
			<td style="width:191px;">OSADA</td>
			<td style="width:429px;">Exl-M40</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Burrs for drill</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific</td>
			<td style="width:429px;">19007-05; 19007-07)</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">Sterilizing bath</td>
			<td style="width:191px;">FST</td>
			<td style="width:429px;">18000-45, Hot Bead Sterilizer</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:387px;">isoflurane chamber/mask</td>
			<td style="width:191px;">Highland Medical Equipment</td>
			<td style="width:429px;">564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">3D scope with arm</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">fiber optic light</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Betadine&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 % (v/v) isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Povidone-Iodine Prep Pads</td>
			<td style="width:191px;">dynarex</td>
			<td style="width:429px;">1108</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CYCLOSPORINE (INJECTION, USP)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 &#956;g per g rodent)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Akorn</td>
			<td style="width:429px;">NDC 17478-235-35</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgifoam</td>
			<td style="width:191px;">Ethicon</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Grip dental cement</td>
			<td style="width:191px;">Dentsply</td>
			<td style="width:429px;">#675571, 675572</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instant SuperGlue&#160;</td>
			<td style="width:191px;">NDindustries</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LOCTITE 4041</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">METABOND</td>
			<td style="width:191px;">C&#38;B</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">no. 0 cover glass</td>
			<td style="width:191px;">Fisher</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">stereotaxic frame&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Kopf</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Rectal probe and heating pad</td>
			<td style="width:191px;">FHC</td>
			<td style="width:429px;">40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">optical breadboard for imaging</td>
			<td style="width:191px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:191px;">Fisher</td>
			<td style="width:429px;">S55667</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kwik-Cast (Silicone elastomer)</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Suture&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Ethicon</td>
			<td style="width:429px;">18&#8217;&#8217;, 1667, 4-0</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">91500-09, 15018-10</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forcepts</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Student Halsted-Mosquito Hemostats</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">91308-12</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Small Vessel Cauterizer Kit</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">18000-00</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hot Bead Sterilizers</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">18000-45</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instrument Case with Silicone Mat</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">20311-21</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat</td>
			<td style="width:191px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:429px;">20810-01</td>
			<td>surgery and stereotaxic injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:387px;">2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td style="width:429px;">FV1200 MPE</td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">Multiphoton laser</td>
			<td style="width:191px;">SpectraPhysics</td>
			<td style="width:429px;">Mai Tai DeepSee</td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">Green Laser</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td style="width:429px;">473 nm Laser</td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">xy translation base</td>
			<td style="width:191px;">Scientifica</td>
			<td style="width:429px;">MMBP</td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">FRET filter cube for YFP and CFP</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">25-X water immersion objective</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">air table</td>
			<td style="width:191px;">Newport</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:387px;">custom built light-tight cage</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td style="width:429px;"></td>
			<td>in vivo imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (cnifers) for optical detection of neurotransmitters in vivo

細胞ベースの神経伝達物質の蛍光は記者（CNiFERs）は、光学的に生体内で脳内の神経伝達物質の放出を検出するための神経科学者のための新しいツールを提供する設計さ。特定CNiFERは、ヒト胚性腎臓安定特定のGタンパク質共役型受容体を発現する細胞、G qを/ 11のGタンパク質に結合し、FRETベースのCa 2+ -detector、TN-XXLから作成されます。受容体の活性化は、FRETシグナルの増加をもたらします。 CNiFERクローンは、 例えば 、ドーパミンD2Rを特定の神経伝達物質のための天然受容体を使用しているためCNiFERsはnMの感度および秒の時間応答を持っています。 CNiFERs直接in vivoでの体積透過を測定するように最適未満、せいぜい100人ミクロンの空間分解能で神経伝達物質の放出を検出するためにそれらを可能にする、脳内に注入されます。 CNiFERsもViに潜在的な交差反応性のために他の薬剤をスクリーニングするために使用することができますVO。我々は最近、G、I / O Gタンパク質へのGPCRにそのカップルを含めるようにCNiFERsの家族を拡大しました。 CNiFERsは、アセチルコリン（AChの）、ドーパミン（DA）およびノルエピネフリン（NE）を検出するために利用可能です。任意のGPCRはCNiFER小説を作成するために使用することができることを考えると、ほぼヒトゲノム中の800のGPCRがあることを、我々は、設計実現、およびCNiFERのいずれかのタイプをテストするために、ここで一般的な手順について説明します。

特定のGタンパク質共役受容体（GPCR）と遺伝的にコードされた[Ca 2+]センサ、TN-XXL：CNiFERを安定少なくとも二つのタンパク質を発現するように操作されたヒト胚腎臓（HEK293）細胞から誘導されます。 TN-XXLは、Ca 2+イオン6,15に対応して、それぞれ、シアンおよび黄色蛍光タンパク質間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を受けるのeCFPおよびシトリ?...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters CNiFERs for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo at JoVE.com

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters CNiFERs for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

私たちは、体積、神経伝達物質の放出を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光工学レポーター（CNiFERs）を作成するためのプロトコルを提示します。

神経伝達物質を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光エンジニア記者の建設（CNiFERs）<em&gt;インビボ</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

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ための間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ·テクニック<emインビボで&gt;</em&gt;光干渉断層イメージング

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

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蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

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モデル星細胞腫発症機序<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

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同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

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の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視<em&gt; ex vivoで</em&gt;マウスの耳皮膚

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

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光干渉断層計: マウス網膜神経節細胞In Vivoイメージング

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

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当然やりがい雌ハムスターの行動中に細胞外の神経伝達物質の生体内変化を測定

The ability to measure neurotransmitter release on a rapid time scale allows patterns of neurotransmission to be linked to specific behaviors or ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

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生体内で蛍光レポーターを使用してマウス視交叉上核における時計遺伝子発現のモニタリング

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...