Name: accurate and phenol free dna sexing of day 30 porcine embryos by pcr
Uploaded: 2016-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer a colaboração e as contribuições financeiras da seguinte agência de financiamento da investigação: Alberta gado e de carne Agency Ltd., CRC carne de porco, carne de porco Alberta, Hypor A Hendrix Genetics Companhia e NSERC CRSNG.

De acordo com a Canadian Council on Animal Care orientações e com a aprovação da Política animal Faculdade e Conselho de Acção Social - Pecuária da Universidade de Alberta, porcas prenhes foram sacrificados por funcionários treinados aproximadamente no dia 30 de gestação e os embriões foram coletados. Use luvas de exame em todos os momentos durante os procedimentos. 1. Colheita e armazenamento Amostra <ol><li> Eutanásia porca usando dardo cativo seguido de sangria. Usar luvas de exame para recolhe...

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	<li>Seidel, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economics+of+selecting+for+sex:+the+most+important+genetic+trait.">Economics of selecting for sex: the most important genetic trait.</a> Theriogenology. 59, 585-598 (2003).</li><li>Guti&#233;rrez-Ad&#225;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+consequences+of+sexual+dimorphism+during+pre-implantation+embryonic+development.">Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development.</a> Reprod. Domest. Anim. 41, 54-62 (2006).</li><li>Rosenfeld, C. S., Roberts, R. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+different+dietary+energy+sources+during+folliculardevelopment+on+subsequent+fertility+of+cyclic+gilts.">Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts.</a> Animal. 8, 293-299 (2014).</li><li>Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L., Rodriguez-Martinez, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+programming+of+postnatal+development+in+the+pig.">Prenatal programming of postnatal development in the pig.</a> Control of Pig Reproduction VIII. , 212-213 (2009).</li></ol>

A maioria dos protocolos existentes relacionadas com DNA embriões digitação sexo suína só são adequados para fase inicial estágio de pré-implantação 15,16. Nós temos desenvolvido com sucesso um protocolo adequado para triagem de embriões suínos durante o final de gestação. Baseado em estudos com estágios de desenvolvimento semelhantes de embriões provenientes de estudos anteriores 6,18, o presente protocolo é considerado mais seguro e de baixo custo. E...

O porco doméstico tornou-se um tema de pesquisa fundamental no desenvolvimento, genética e nutrição em ambos os sectores humanas e animais. O potencial de porcos como modelo para a investigação biomédica humana pode ser atribuído às suas semelhanças fisiológicas. Na pecuária, a manipulação da proporção entre os sexos pode aumentar a eficácia dos programas de selecção e melhoramento genético 1. Sexagem de embriões individuais é uma ferramenta fundamental usada em muitas investigações experimentais, incluindo mas não limitado a genótipo, epigenética e X inactivação de dimorfismo sexual durante o desenvolvimento embrionário precoce 2. Estudos em camundongos sugerem que a dieta materna e outros fatores podem resultar em desequilíbrio entre os sexos 3. Em suínos, as causas do sexo rácio desequilíbrio incluem raça paterna 4, capacidade uterina 5, e estado metabólico da porca 6. Uma vez que as diferenças observadas em embriões e ninhadas pode ser influenciada por SExual dimorfismo, os pesquisadores devem estar cientes do sexo do embrião e relações sexuais antes de tirar conclusões sobre a sua pesquisa. O desenvolvimento de ferramentas e protocolos eficientes para a sexagem de embriões de suínos no dia 30 do desenvolvimento será discutido aqui. Vários métodos de tipagem sexo têm sido desenvolvidos para estudos genéticos em organismos modelo e gado. Particularmente na pecuária, a identificação de embriões masculinos e femininos é uma prática muito comum para melhorar a seleção genética para programas de melhoramento. Embriões precoces cariótipo no porco usando Giemsa 7 ou as intensa fluorescência 8,9 técnicas têm sido utilizadas para tipagem sexo. No entanto, estes métodos são demorados e não é adequado para o rastreio de grandes números de embriões com rapidez e precisão. O método sexo tipagem mais eficaz é a amplificação de DNA usando uma polimerase de ADN estável ao calor e um par de iniciadores. sexagem de DNA pelo método de PCR é mais específico, rápido e sensível, oomente requerendo uma pequena quantidade de materiais celulares. O primeiro sexagem de embriões com base em PCR foi realizado em seres humanos 10, e mais tarde nos ratos 11, 12 bovinos, búfalos, ovelhas 13 14 embriões pré-implantação. No porco, o método de tipagem de ADN mais rapidamente do sexo foi estabelecida para os embriões pré-implantação através de um único par de Y-chromosome iniciadores de ADN específica 15. No entanto, os iniciadores de PCR mais comuns para a determinação do sexo foram selecionados a partir do cromossomo Y do gene SRY específica do sexo masculino 16 e os não-sexo região discriminativo de um gene zinc-finger localizado na X e Y cromossomo 17. Subsequentemente, estes iniciadores foram utilizados para determinar o sexo dos embriões do dia 30 no estudo com uma melhor especificidade dos primers para detectar apenas o cromossoma X de um gene de dedo de zinco. O ADN genómico a partir de embriões pré-implantação de suíno pode ser extraído por exposição de um blastocisto intacto para tamponar com proteinase K 16 ou por tomar uma biópsia de algumas células da clivagem antecipada individual embriões 15 e usá-los para PCR direta. No entanto, a libertação de ADN a partir de sangue de porcino, cabelo, tecidos ou um grande conceptus ao longo de alguns centímetros de tamanho não é efectivamente feito usando o método de proteinase K. Métodos de extração de DNA para estes materiais foram estabelecidas usando ou demoradas protocolos de fenol / clorofórmio 6 ou kits baseados coluna caro 18. A fim de evitar o uso de produtos químicos potencialmente tóxicos, há uma tendência para o desenvolvimento de métodos de extracção de ADN de baixo custo, simples e livre de fenol. Este tipo de protocolo para o isolamento de ADN genómico por PCR qualidade do rato 19 e 20 de peixe-zebra tecidos foi estabelecida usando hidróxido de sódio quente e tris (HOTSHOT). Este estudo fornece um protocolo para obter DNA com pares de primers duplex modificados Hotshot e redesenhado para o sexo PCR digitando diretamente a partir de lisados ​​celulares de dia 30 embriões de suínos comalta precisão.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1184">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:203px;">KAPABiosystems</td>
			<td style="width:189px;">KR0370</td>
			<td style="width:463px;">other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:189px;">S33102</td>
			<td>Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Pig female and male genomic DNA</td>
			<td style="width:203px;">Zyagen</td>
			<td style="width:189px;">GP-160-F1 &#38; GP-160-M5</td>
			<td>Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Typhoon FLA 9500 laser scanner</td>
			<td style="width:203px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:189px;">28-9969-43</td>
			<td>other imaging system can be used</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Free Soft Nitrile Examination Gloves</td>
			<td style="width:203px;">WWR</td>
			<td>89038-270</td>
			<td>any other examination glove can be used</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Sodium hydroxide, solid&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher</td>
			<td style="width:189px;">BP 359 -212</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:189px;">0030 108.051</td>
			<td>heat resistant</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">ThermoStat plus</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:189px;">22670204</td>
			<td>Use as a incubator for 95C, don&#39;t need to use the heater</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Toothpick</td>
			<td>Bunzl Plc</td>
			<td style="width:189px;">75200815</td>
			<td style="width:463px;">Any round wooden toothpicks can be used - quality wood</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:331px;">Microcentrifuge 5417R/5417C</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:189px;">22621807</td>
			<td>This model was discontinued. But another newer model can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microspatula</td>
			<td style="width:203px;">Fisher</td>
			<td style="width:189px;">SDI28540115</td>
			<td>Autoclaved before use each time.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate and phenol free dna sexing of day 30 porcine embryos by pcr

A investigação sobre a programação pré-natal no porco mostrou que o sexo do embrião ou feto em desenvolvimento pode influenciar o resultado do desenvolvimento. Portanto, a capacidade de determinar o sexo de um embrião é necessário em muitas experiências particularmente em relação ao desenvolvimento precoce. O presente protocolo demonstra uma preparação de baixo custo, rápida e não-tóxico de ADN genómico de porco para uso com a PCR. Dia 30 embriões devem ser humanamente recolhido de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Política de animal Institucional e Comissões de bem-estar para o presente protocolo. A preparação de todo o embrião para esta técnica sexagem baseado na PCR envolve simplesmente moer o embrião congelado até um pó fino usando um almofariz pré-arrefecido e um pilão. ADN por PCR qualidade é libertado a partir de uma pequena quantidade de pó de embriões através da aplicação de uma incubação a quente em um reagente de lise alcalina. Em seguida, a solução de ADN é misturado com tampão de neutralização e utilizado directamente para PCR. Dois pares de iniciadores são gerados para detecdeterminado sexo t determinação região do cromossoma Y (SRY) e região ZFX do cromossoma X com alta precisão e especificidade. O mesmo protocolo pode ser aplicado a outros embriões alongados (dia 10 ao dia 14) anteriores ao Dia 30. Além disso, este protocolo pode ser realizada com placas 96-brotaram quando o rastreio de um grande número de embriões, tornando viável para automatização e de alta digitação sexo rendimento.

Um resultado representativo de determinação do sexo de 345 lisados ​​de ADN de rastreio por PCR é mostrado na Figura 7 e sumariados na Tabela 1. Como pode ser visto na Figura 7, a temperatura de iniciadores de recozimento a 65 ° C representa a condição óptima neste protocolo de PCR gerando intensidade semelhante e t...

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Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Precisas e Fenol DNA Sexagem gratuito do dia 30 de Porcina embriões por PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

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