Name: evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

يتم اعتماد مختبر يه بواسطة تمويل البحوث من الجمعية الأمريكية للسرطان المؤسسية منحة بحثية (IRG-97-219-14) منحت لمركز هولينغ السرطان في MUSC، من خلال تمويل البحوث من منحة وزارة الدفاع (W81XWH-11-2- 0229) في MUSC، وجائزة من القلق مؤسسة (لESY).

بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية والمعايير رعاية الحيوان من كلية الطب بجامعة ولاية كارولينا الجنوبية (MUSC) ورعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC). 1. الرئة تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثديية تشريح الورم (ا...

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول استخدام QRT-PCR لتقييم الثديية ورم خبيث الخلايا السرطانية إلى الرئة باستخدام نموذج طعم أجنبي الماوس. ومن المسلم به أن التقنيات الأخرى، بما في ذلك التصوير إضاءة الحيوية، متاحة وفعالة للكشف عن ورم خبيث الرغم من وجود قيمهم والقيود أيضا. البيانات المقدم?...

ويقترح تحليل QRT-PCR كوسيلة لتقييم الورم ورم خبيث. ويقترح هذا الأسلوب كبديل للمستخدمين الذين يرغبون في تقييم ورم خبيث ولكن قد لا يكون الحصول على معدات معينة مثل في الجسم الحي معدات التصوير أو مضان المجسام قادرة. وتقدم يتبع مناقشة الأساليب المستخدمة عادة من قبل مظاهرة لكيف يمكن استخدام تحليل QRT-PCR إما منفصلة أو كوسيلة مصاحب لتقييم ورم خبيث. هذا الإجراء لديه القدرة على تقديم تحليل كمي لعبء النقيلي. الطرق المعيارية لتحليل الإجمالي، بما في ذلك التصور من الرئتين تحت stereomicroscope وكذلك باجتزاء المسلسل تليها الهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E) تلطيخ من أنسجة الرئة، وقابلة للقياس الكمي ولكن تعتمد بشكل كبير على المستخدم تعريف المعلمات لحساب 2-5. عند تقييم الرئتين بأكملها باستخدام stereomicroscope، الانبثاث السطح الكبيرة فقط هي VISIبليه ويتطلب تحليل المحقق أن لديهم معرفة معقولة من الرئة التركيب التشريحي لتحديد ما يشكل آفة المتنقل. وضع العلامات الفلورية من الخلايا السرطانية مع علامة مثل GFP واستخدام stereomicroscope الذي يحتوي مكعب الضوء مع ماكسيما المناسب الإثارة / الانبعاثات (على سبيل المثال قرب 470/510 نانومتر لGFP) يساعد في هذه العملية، ولكن فقط العقيدات الورم سطح قابلة للكشف . بالإضافة إلى ذلك، مضان من تلوث الدم، وهو أمر واضح تحت نفس المعلمات كما GFP، قد يؤدي إلى هوية مزورة من الآفات النقيلي المحتملة. باجتزاء في الرئة تليها H &amp; E تلطيخ لتصور الانبثاث الرئة هو طريقة مفيدة لتقييم micrometastases والعمليات المجهرية الأخرى بما في ذلك تسلل الخلايا المناعية ولكن غالبا ما يتطلب استخدام أنسجة الرئة بالكامل لتضمين البارافين، باجتزاء، والإجراءات تلطيخ. ولذلك، الإجراءات النهائية ليست مثالية تتبع هذا methoد. على الرغم من أن قياس الكمي، هذا الإجراء يتطلب المحقق لتقييم عدد كبير من أقسام الرئة الملون لكل حيوان للتأكد من أن التحليل يمثل هيكل 3D كامل من الرئة. ونتيجة لذلك، وهذا النوع من الفحص هو مضيعة للوقت، يمكن أن يؤدي إلى احتساب الخطأ، وتحليل يعتمد بشكل كبير على محقق تقدير. العديد من تقنيات التصوير في الجسم الحي (مثل التصوير بالرنين المغناطيسي، PET، SPECT) وتستخدم حاليا لإجراء اختبار أو العمليات البيولوجية في نماذج القوارض التجريبية 8. في الجسم الحي التصوير إضاءة الحيوية هو أسلوب شائع استخدامها للحصول على رأي الإجمالي من ورم خبيث 9. يتم تطبيق هذه التقنية بشكل عام لتقييم وجود نشاط luciferase المراسل بسبب تراكم الخلايا السرطانية، والتي صممت لاحتواء عنصر استجابة luciferase المراسل، الموجودة في أجهزة معينة مثل الغدة الثديية بعد زرع الخلايا السرطانية والرئة على الانبثاث عفوية 1وبفعل 0 التصور النشاط luciferase المراسل عن وجود الركيزة وسيفيرين (D-وسيفيرين). luciferase المراسل يحفز نزع الكربوكسيل التأكسدي من D-وسيفيرين إلى oxyluciferin توليد تلألؤ بيولوجي. في حين بالمعلومات، وهذه الطريقة محدودة بسبب العديد من العوامل بما في ذلك استقرار الركيزة (أي قصيرة العمر النصفي)، التوزيع المناسب للالركيزة التي تعتمد على كيفية تسليمها إلى حيوانات التجارب، وانخفاض الحساسية للكشف عن 9. A الفضل الاساسي لهذه التقنية هي أنها غير الغازية، لا يمكن أن يؤديها على الحيوانات الحية، ويمكن أن يؤدي إلى الكشف عن النقائل الخلايا السرطانية في الأجهزة المتعددة التي ربما لم تحصد عادة في تشريح 9،10. وأحد الجوانب الإيجابية للفي الجسم الحي تقنيات التصوير هو أن أنسجة الرئة ودون أن يمسها السماح للإجراءات الثانوية مثل البارافين التضمين أو المعروضة هنا، تحليل QRT-PCR. ومع ذلك، لأن QRT-PCR هو theoreticaLLY مقياسا أكثر حساسية من الكشف والتقييم الإجمالي قد لا تكشف عن انخفاض أعداد الخلايا السرطانية موجودة في الرئة. وإن كان مفيدا، وتقنيات التصوير المذكورة أعلاه يمكن أن تكون بديلا أو تستكمل مع أسلوب QRT-PCR توصف حاليا. QRT-PCR لديه القدرة على توفير قدر حساسية مرنا المستمدة من ورم داخل الرئة.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

المرض المنتشر هو انتشار الخلايا السرطانية الخبيثة من موقع السرطان الأساسي لجهاز بعيد وهو السبب الرئيسي لسرطان الوفيات المرتبطة 1. وتشمل المواقع المشتركة للانتشار النقيلي الرئة، العقدة الليمفاوية والمخ، والعظام 2. الآليات التي تدفع الانبثاث هي مناطق مكثفة لأبحاث السرطان. ونتيجة لذلك، المقايسات فعالة لقياس العبء المنتشر في مواقع بعيدة الانبثاث هي مفيدة لأبحاث السرطان. تقييم الانبثاث الرئة في نماذج ورم الثدي تتم عادة عن طريق الملاحظة النوعية الإجمالية للأنسجة الرئة بعد تشريح. الأساليب الكمية لتقييم ورم خبيث تقتصر حاليا لخارج الحي وتقنيات التصوير مقرها الجسم الحي والتي تتطلب المعلمات التي يحددها المستخدم. العديد من هذه التقنيات هي في مستوى الحي كله وليس على المستوى الخلوي 3-6. على الرغم من أن وسائل التصوير الجديدة استخدام متعدد الفوتون المجهر قادرة على تقييم metastasis على المستوى الخلوي 7، هذه الإجراءات أنيقة للغاية هي أكثر ملاءمة لتقييم آليات نشر بدلا من التقييم الكمي للعبء النقيلي. هنا، يتم تقديم طريقة بسيطة في المختبر لتقييم كمي لورم خبيث. باستخدام كمية الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR)، ويمكن الكشف عن مرنا الخلايا السرطانية معين داخل أنسجة الرئة الماوس.

ما وراء الوقت المستغرق لأداء التلقيح الأولي من الخلايا السرطانية في حيوانات التجارب وإذا المنفذ، والابتدائي في تحليل الورم الجسم الحي، وحصاد الأنسجة والعزلة RNA، وتحليل QRT-PCR هو إجراء 1-2 يوم (الشكل 1) . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR) للكشف عن مرنا محددة الخلايا السرطانية تمثل ورم خبيث في الأنسجة الماوس الرئة.

تقييم الرئة الانبثاث في ماوس الثديية ورم المجموعات بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

تقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الأورام في الوقت الحقيقي باستخدام التصوير Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

في ضوء بارد التصوير حيوية الجسم الحي من نقص الأكسجة ورم من الدماغ الانبثاث سرطان الثدي في نموذج الفأر

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

الكشف microRNA في أورام البروستات بواسطة PCR الوقت الحقيقي الكمية (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Models of Bone Metastasis

نماذج من الانبثاث العظام

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

يعيش التصوير من الاستجابة للأدوية الأورام المكروية في في نماذج الماوس من سرطان الثدي

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR لتحديد الجهات المانحة Engraftment خلية في التنافسية نموذج الفئران زرع نخاع العظم

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

طريقة بسيطة لتركيب الانبوبة الرئة ماوس

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

بدء النقيلي سرطان الثدي عن طريق استهداف ظهارة الأقنية مع اتش، لجنة المساواة العرقية: رواية المعدلة وراثيا نموذج الفأر من سرطان الثدي

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

النخاعي السوائل عن طريق الرنا الميكروي التنميط الكمي في الوقت الحقيقي PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

ورم الابتدائي وMEF عزل الخلايا لدراسة الرئة الانبثاث

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...