Name: evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Den Yeh lab er støttet af forskningsmidler fra en American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) tildelt den Hollings Cancer Center på MUSC ved forskningsmidler fra en Department of Defense tilskud (W81XWH-11-2- 0229) på MUSC og ved en pris fra Concern Foundation (til ESY).

Protokollen følger de retningslinjer og dyr pleje standarder for Medical University of South Carolina (MUSC) og dens Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). 1. Lung Dissektion <ol><li> Mammatumor dissektion (ekstraudstyr afhængig af undersøgelsens mål, og om primær tumor analyse eller haleveneinjektion blev udført). <ol><li> Aflive musen ved hjælp af en dødelig dosis af isofluran anæstesi ifølge IACUC og universitet regulering. Bekræft euthanization ved kirurgisk dislokation. </li><li> På...

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

Denne protokol beskriver anvendelse af QRT-PCR at vurdere mamma tumorcellemetastase til lungen ved hjælp af et xenotransplantat musemodel. Det erkendes, at andre teknikker, herunder bioluminescerende billeddannelse, er tilgængelige og er også effektive til påvisning af metastaser trods deres egne værdier og begrænsninger. De fremlagte data viser, at QRT-PCR giver en effektiv foranstaltning til påvisning af tumor-afledte mRNA inden lungevæv til kvantificering af den samlede metastase. Det foreslås, at QRT-PCR-an...

Foreslås QRT-PCR-analyse som en metode til vurdering tumormetastase. Foreslås denne metode som et alternativ for brugere, der er interesseret i at evaluere metastaser, men måske ikke har adgang til særligt udstyr såsom in vivo imaging udstyr eller en fluorescens stand stereoskop. En diskussion af almindeligt anvendte metoder præsenteres efterfulgt af en demonstration for, hvordan QRT-PCR-analyse kan anvendes enten som en separat eller som ledsager metode til at evaluere metastase. Denne fremgangsmåde har potentialet til at tilvejebringe en kvantitativ analyse af metastatisk byrde. Standard metoder til grov analyse, herunder visualisering af lungerne under et stereomikroskop samt seriel sektionering efterfulgt af hæmatoxylin og eosin (H &amp; E) farvning af lungevæv, er kvantificerbare, men er stærkt afhængige brugerdefinerede parametre for at tælle 2-5. Ved evalueringen hele lunger ved hjælp af et stereomikroskop, kun store overflade metastaser er visible og analyse kræver investigator til at have rimeligt kendskab til lunge anatomiske struktur til at afgøre, hvad der udgør en metastatisk læsion. Fluorescerende mærkning af tumorceller med en markør, såsom GFP og anvendelse af et stereomikroskop, som indeholder en let kube med passende excitation / emission maxima (f.eks tæt 470/510 nm for GFP) bistår i denne proces, men kun overfladen tumorknuder kan påvises . Derudover fluorescens fra blod forurening, som er synlig under de samme parametre som GFP, kan føre til falsk identifikation af mulige metastatiske læsioner. Sektionering af lungen, efterfulgt af H &amp; E-farvning til visualisering af lungemetastase er en nyttig metode til at evaluere mikrometastaser og andre mikroskopiske processer, herunder immune celleinfiltration, men kræver ofte brug af hele lungevæv for indlejring i paraffin, sektionering og farvning procedurer. Derfor er downstream procedurer ikke ideelle følger denne method. Selv kvantificerbare, denne procedure kræver investigator at evaluere et stort antal farvede lungesnit hvert dyr for at sikre, at analysen tegner sig for hele 3D-struktur af lungen. Derfor denne type undersøgelse er tidskrævende, kan føre til at tælle fejl, og analyse stærkt afhængig investigator skøn. Adskillige in vivo imaging-teknikker (f.eks MRI, PET, SPECT) er i øjeblikket bruges til at udføre eller teste biologiske processer i eksperimentelle gnavermodeller 8. In vivo bioluminiscerende billeddannelse er en fælles metode, der anvendes til at erhverve en grov visning af metastaser 9. Denne teknik anvendes generelt til at vurdere tilstedeværelsen af ​​luciferase reporter aktivitet på grund af ophobning af tumorceller, som er manipuleret til at indeholde en luciferaserespons element, der er placeret i bestemte organer som brystkirtlen efter tumorcelleimplantation og lungen ved spontan metastase 10. Visualisering af luciferase reporter aktiviteten induceres ved tilstedeværelsen af luciferin substrat (D-luciferin). Luciferase katalyserer oxidativ decarboxylering af D-luciferin at oxyluciferin generere bioluminescens. Mens informativ, er denne metode begrænset af flere faktorer, herunder substrat stabilitet (dvs. korte halveringstid), passende fordeling af substrat, som afhænger af, hvordan det leveres til forsøgsdyr, og lav følsomhed afsløring 9. En af de vigtigste fortjeneste til denne teknik er, at det er ikke-invasiv, kan udføres på levende dyr, og kan føre til påvisning af tumor celle metastaser i flere organer, der ikke har været normalt høstet ved dissektion 9,10. Et positivt aspekt af in vivo-billeddannelse teknikker er, at lungevævet er uforstyrret giver mulighed for sekundære procedurer som paraffinindlejring eller som præsenteres her, QRT-PCR-analyse. Men fordi QRT-PCR er theoretically en mere følsom måling af detektion, kan grov evaluering ikke afsløre lavt antal tumorceller til stede i lungerne. Nyttige, kan de billeddannende teknikker beskrevet ovenfor være substitueret eller suppleres med QRT-PCR-fremgangsmåden øjeblikket beskrevet. QRT-PCR har potentialet til at tilvejebringe et følsomt mål for tumorafledte mRNA i en lunge.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

Metastatisk sygdom er spredningen af maligne tumorceller fra den primære kræft websted til et fjernt organ, og er den primære årsag til kræft forbundet død 1. Almindelige steder af metastatisk spredning indbefatter lunge, lymfeknude, hjerne og knogler 2. Mekanismer, der driver metastaser er intense områder af kræftforskning. Derfor effektive analyser måle metastatisk byrde i fjerne steder for metastaser er medvirkende til kræftforskning. Evaluering af lungemetastaser i mammae tumormodeller udføres generelt ved grov kvalitativ observation af lungevæv efter dissektion. Kvantitative metoder til evaluering metastaser er i øjeblikket begrænset til ex vivo og in vivo imaging teknikker, der kræver brugerdefinerede parametre. Mange af disse teknikker er på hele organismen snarere end det cellulære niveau 3-6. Selv om nyere billeddannende fremgangsmåder under anvendelse af multi-foton mikroskopi er i stand til at vurdere metasTASIS på celleniveau 7, disse meget elegante procedurer er mere egnet til at evaluere mekanismer formidling snarere end kvantitativ vurdering af metastatisk byrde. Her er en simpel in vitro metode til kvantitativ vurdering metastase fremlagt. Anvendelse af kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR), kan tumorcellespecifik mRNA påvises i mus lungevæv.

Ud over den tid, det tager at udføre den indledende inokulering af tumorceller i forsøgsdyret og hvis udførelse, primær in vivo tumor analyse, vævet høsten RNA-isolering, og QRT-PCR-analyse er en 1-2 dages procedure (figur 1) . Et eksempel på grov analyse bioluminescerende billeddannelse at evaluere tumorceller i lungevævet. Her blev en mamma tumorgenese eksperiment udført for at vurdere, om ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Denne protokol beskriver, hvordan man bruger kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) til påvisning af tumorcellespecifikke mRNA repræsenterer metastase i mus lungevæv.

Evaluering af lungemetastase i musebrysttumor modeller af kvantitativ real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA Påvisning i prostata tumorer ved kvantitativ real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Models of Bone Metastasis

Modeller af knoglemetastaser

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Levende Imaging af Drug respons i den tumormikromiljøet i musemodeller af Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Brug af kvantitativ real-time PCR til Bestem donorcelle indpodning i en konkurrencepræget murin knoglemarvstransplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

En simpel metode til Mouse Lung Intubation

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Indledning af metastatisk brystkræft karcinom ved Målretning af Duktalt epitel med Adenovirus-Cre: A Novel transgene mus Model for brystkræft

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinalvæske microRNA ved brug af kvantitativ real time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Primær tumor og MEF Cell Isolation at studere Lung Metastase

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...