Name: evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

De Yeh lab wordt ondersteund door de financiering van onderzoek van een American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) toegekend aan de Hollings Cancer Center op MUSC, door de financiering van onderzoek van het Ministerie van Defensie subsidie ​​(W81XWH-11-2- 0229) op MUSC, en door een award van het Concern Foundation (tot ESY).

Het protocol volgt de richtlijnen en verzorging van dieren normen van de Medische Universiteit van Zuid-Carolina (MUSC) en de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Borsttumor dissectie (optioneel afhankelijk van de studie doelen en of de primaire tumor analyse of staartader injectie werd uitgevoerd). <ol><li> Euthanaseren muis met behulp van een dodelijke dosis van isofluraananesthesie volgens IACUC en universitaire regelgeving. Bevestig euthanization door chirurgisch...

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

Dit protocol beschrijft het gebruik van QRT-PCR om mammaire tumorcelmetastase evalueren aan de longen met een xenograft muismodel. Er wordt erkend dat andere technieken, zoals bioluminescentie beeldvorming, zijn beschikbaar en zijn ook effectief voor het detecteren van metastasen ondanks hun eigen waarden en beperkingen. De gepresenteerde gegevens suggereren dat QRT-PCR een effectieve maatregel detecteren tumor afgeleide mRNA in longweefsel voor kwantificering van totaal metastase. Voorgesteld wordt QRT-PCR analyse een ...

QRT-PCR analyse is voorgesteld als een werkwijze voor het beoordelen van tumormetastase. Deze werkwijze is voorgesteld als een alternatief voor gebruikers die geïnteresseerd zijn in de beoordeling metastase zijn slechts toegankelijk voor bepaalde apparatuur niet zoals in vivo beeldvormende apparatuur of fluorescentie staat stereoscoop. Een bespreking van de meest gebruikte methoden gepresenteerd, gevolgd door een demonstratie van hoe QRT-PCR-analyse kan worden gebruikt als een afzonderlijke of als gezelschap methode om metastase te beoordelen. Deze procedure heeft het potentieel om een ​​kwantitatieve analyse van metastatische belasting verschaffen. Standaardmethoden van de bruto-analyse, met inbegrip van visualisatie van de longen onder een stereomicroscoop evenals seriële snijden, gevolgd door hematoxyline en eosine (H &amp; E) kleuring van longweefsel, kwantificeerbaar zijn maar sterk afhankelijk van door de gebruiker gedefinieerde parameters voor het tellen van 2-5. Bij de evaluatie van hele longen met behulp van een stereomicroscoop, alleen grote oppervlakte uitzaaiingen zijn visible en analyse vereist de onderzoeker om een ​​redelijke kennis van de long anatomische structuur te bepalen wat een metastatische laesie te hebben. Fluorescentielabelling van tumorcellen met een merker zoals GFP en het gebruik van een stereomicroscoop met een lichte kubus met de geschikte excitatie- / emissie maxima (bijv nabij 470/510 nm voor GFP) bevat helpt bij dit proces, maar alleen aan de oppervlakte tumornoduli detecteerbaar . Bovendien fluorescentie van bloed verontreinigingen, die zichtbaar worden onder dezelfde parameters als GFP is, kan leiden tot vals identificeren van mogelijke metastatische laesies. Snijden van de long, gevolgd door H &amp; E kleuring long metastase visualiseren is een nuttige methode om micrometastasen en andere microscopische processen zoals immune infiltratie te evalueren, maar het gebruik van de gehele long weefsel voor inbedden in paraffine, snijden en kleuringen vereist vaak. Daarom stroomafwaartse procedures niet ideaal na deze method. Hoewel kwantificeerbaar, vereist deze procedure de onderzoeker een groot aantal gekleurde longsecties per dier evalueren om te garanderen dat de analyse rekening voor de gehele 3D-structuur van de longen. Bijgevolg is dit type onderzoek is tijdrovend, kan leiden tot het tellen fout, en analyse leunt zwaar op de onderzoeker discretie. Verscheidene in vivo beeldvormende technieken (bijvoorbeeld MRI, PET, SPECT) worden momenteel gebruikt uitvoeren of testen biologische processen in experimentele diermodellen 8. Bioluminescentie beeldvorming is een gemeenschappelijke methode om een bruto weergave van metastase 9 verwerven. Deze techniek wordt algemeen op de aanwezigheid van luciferase-reporter-activiteit te evalueren als gevolg van de accumulatie van tumorcellen die zijn ontworpen om een ​​luciferase responselement bevatten, die in bepaalde organen zoals de melkklier na tumorcel implantatie en de longen op spontane metastase verblijven 10. Visualisatie van luciferase-activiteit wordt geïnduceerd door de aanwezigheid van luciferine substraat (D-luciferine). Luciferase katalyseert de oxidatieve decarboxylering van D-luciferine tot oxyluciferine genereren bioluminescentie. Terwijl informatief, is deze werkwijze beperkt door verscheidene factoren, waaronder substraat stabiliteit (bijv korte halfwaardetijd), adequate verdeling van substraat hangt af van hoe het wordt geleverd aan proefdieren en lage detectiegevoeligheid 9. Een belangrijke verdienste van deze techniek is dat het niet-invasief kan worden uitgevoerd op levende dieren, en kan leiden tot de detectie van tumorcellen metastasen in meerdere organen die niet zijn normaliter geoogst dissectie 9,10. Een positief aspect van in vivo imaging technieken is dat het longweefsel wordt ongestoorde waardoor secundaire procedures zoals paraffine inbedding of zoals hier gepresenteerd, QRT-PCR-analyse. Omdat QRT-PCR theoretically een gevoeligere maat voor detectie bruto evaluatie niet gering aantal tumorcellen in de long zichtbaar. Hoewel nuttig, kan de beeldvormende technieken hierboven beschreven gesubstitueerd of aangevuld met QRT-PCR methode die momenteel beschreven. QRT-PCR heeft het potentieel om een ​​gevoelige maatstaf van tumor afgeleide mRNA binnen een long.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

Metastatische ziekte is de verspreiding van kwaadaardige tumorcellen uit de primaire kankertype naar een verre orgaan en is de primaire oorzaak van kanker-geassocieerde overlijden 1. Voorkomende plaatsen van metastatische verspreiding omvatten longen, lymfeklieren, hersenen en bot 2. Mechanismen die metastase rijden zijn intense gebied van kankeronderzoek. Bijgevolg effectieve assays voor uitgezaaide last te meten in verre plaatsen van metastase zijn instrumenteel voor kankeronderzoek. Evaluatie van longmetastasen in borsttumor modellen wordt in het algemeen uitgevoerd door het bruto kwalitatieve observatie van longweefsel na dissectie. Kwantitatieve evaluatie van metastasen momenteel beperkt tot ex vivo en in vivo imaging gebaseerde technieken die gebruiker gedefinieerde parameters vereisen. Veel van deze technieken zijn op het hele organisme niveau in plaats van het cellulaire niveau 3-6. Hoewel nieuwere beeldvormende methoden gebruik te maken van multi-foton microscopie zijn in staat om metas evaluerenTasis op cellulair niveau 7, deze zeer elegante procedures zijn meer geschikt voor het evalueren mechanismen van verspreiding dan kwantitatieve beoordeling van metastatische belasting. Hier is een eenvoudige in vitro werkwijze kwantitatief beoordelen metastase gepresenteerd. Met behulp van kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR), kan tumorcel specifieke mRNA worden gedetecteerd in de muis longweefsel.

Voorbij de tijd die nodig is om de initiële inoculatie van tumorcellen te voeren in het proefdier en zo uitvoeren, de primaire tumor in vivo analyse van het weefsel oogst, RNA-isolatie en QRT-PCR analyse een 1-2 dagen procedure (figuur 1) . Een voorbeeld van grove analyse bioluminescentie beeldvorming tumorcellen te evalueren in het longweefsel. Hier werd een borstklier tumorgenese experiment uitgevo...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Dit protocol wordt beschreven hoe kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR) gebruikt om tumorcel specifieke mRNA die metastase in de muis longweefsel detecteren.

Evaluatie van longmetastase in muizenborsttumorvirus Modellen van kwantitatieve real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo bioluminescentie van Tumor Hypoxie Dynamiek van Borstkanker hersenmetastasen in een muismodel

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA Detectie in prostaattumoren op Kwantitatieve Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Models of Bone Metastasis

Modellen van bot metastase

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Met behulp van kwantitatieve real-time PCR voor donorcel Engraftment bepalen in een concurrerende Murine beenmergtransplantatie Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Een eenvoudige methode van de Muis van Lung intubatie

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Initiatie van gemetastaseerd borstcarcinoom door Targeting van de Ductaal Epitheel met adenovirus-Cre: A Novel transgeen muismodel van de Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Primaire tumor en MEF Cell Isolation om te studeren longmetastase

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...