Name: evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Le laboratoire Yeh est soutenu par un financement de la recherche à partir d&#39;un American Cancer Society institutionnel de subventions de recherche (IRG-97-219-14) sera décerné au Cancer Center Hollings à la MUSC, par le financement de la recherche à partir d&#39;un Département de la Défense subvention (W81XWH-11-2- 0229) à la MUSC, et par un prix de la Fondation Concern (à ESY).

Le protocole suit les lignes directrices et les normes de protection des animaux de l&#39;Université médicale de Caroline du Sud (MUSC) et son institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Dissection de la tumeur mammaire (en option selon les objectifs de l&#39;étude et si l&#39;analyse de la tumeur primaire ou veine de la queue injection a été effectuée). <ol><li> Euthanasier la souris en utilisant une dose létale de l&#39;isoflurane selon IA...

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

Ce protocole décrit l&#39;utilisation de QRT-PCR pour évaluer mammaire métastatique des cellules tumorales dans le poumon en utilisant un modèle de xénogreffe de souris. Il est reconnu que d&#39;autres techniques, y compris l&#39;imagerie bioluminescente, sont disponibles et sont également efficaces pour détecter les métastases malgré leurs propres valeurs et limites. Les données présentées suggèrent que QRT-PCR fournit une mesure efficace de la détection de l&#39;ARNm d&#39;origine tumorale dans le tissu ...

Analyse QRT-PCR est proposée comme méthode d&#39;évaluation de la métastase tumorale. Cette méthode est proposé comme une alternative pour les utilisateurs qui sont intéressés à évaluer les métastases, mais peuvent ne pas avoir accès à des équipements spécifiques tels que les équipements d&#39;imagerie in vivo ou un stéréoscope capable de fluorescence. Une discussion des méthodes couramment utilisées est présenté suivi d&#39;une démonstration de la façon dont l&#39;analyse QRT-PCR peut être utilisée soit comme distinct ou comme une méthode complémentaire pour évaluer les métastases. Cette procédure a le potentiel de fournir une analyse quantitative de la charge métastatique. Les méthodes standard d&#39;analyse brute, y compris la visualisation des poumons sous un stéréomicroscope ainsi que le sectionnement de série suivie par hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E) coloration du tissu pulmonaire, sont quantifiables, mais dépendent fortement de paramètres définis par l&#39;utilisateur pour compter 2-5. Lors de l&#39;évaluation poumons entiers en utilisant une loupe binoculaire, seules les grandes métastases de surface sont visiFIL et l&#39;analyse nécessite l&#39;enquêteur d&#39;avoir une connaissance raisonnable des poumons structure anatomique pour déterminer ce qui constitue une lésion métastatique. Le marquage fluorescent des cellules tumorales avec un marqueur tel que la GFP et l&#39;utilisation d&#39;un microscope stéréoscopique qui contient un cube de lumière avec des maxima d&#39;excitation / émission approprié (par exemple, près de 470/510 nm pour GFP) assiste dans ce processus, mais seulement nodules tumoraux de surface sont détectables . En outre, la fluorescence de la contamination du sang, qui est visible dans les mêmes paramètres que la GFP, peut conduire à une fausse identification de lésions métastatiques possibles. Sectionnement du poumon, suivi par coloration H &amp; E pour visualiser une métastase pulmonaire est une méthode utile pour évaluer les micrométastases et les autres processus microscopiques, y compris l&#39;infiltration des cellules immunitaires, mais nécessite souvent l&#39;utilisation du tissu du poumon entier pour inclusion dans la paraffine, de sectionnement, et des procédures de coloration. Par conséquent, les procédures en aval ne sont pas idéales suite de cette méthoré. Bien quantifiable, cette procédure nécessite l&#39;enquêteur d&#39;évaluer un grand nombre de sections pulmonaires colorées par animal pour assurer que les comptes de l&#39;analyse de la structure du poumon 3D entier. Par conséquent, ce type d&#39;examen est consommatrice de temps, peut conduire à des erreurs de comptage, et l&#39;analyse repose largement sur la discrétion d&#39;investigateur. Plusieurs techniques d&#39;imagerie in vivo (par exemple, IRM, PET, SPECT) sont actuellement utilisés pour effectuer ou de tester les processus biologiques dans des modèles rongeurs expérimentaux 8. Dans l&#39;imagerie bioluminescente in vivo est une méthode couramment utilisée pour acquérir une vision brute de métastases 9. Cette technique est généralement appliquée pour évaluer la présence de l&#39;activité de rapporteur de luciférase due à l&#39;accumulation de cellules tumorales, qui sont conçus pour contenir un élément de réponse de la luciférase, qui résident dans des organes spécifiques tels que la glande mammaire après l&#39;implantation des cellules tumorales et les poumons lors de métastase spontanée 10. La visualisation de l&#39;activité rapporteur de la luciférase est induite par la présence du substrat de luciférine (D-luciférine). La luciférase catalyse la décarboxylation oxydative de D-luciférine pour générer oxyluciférine bioluminescence. Bien qu&#39;il soit informatif, cette méthode est limitée par plusieurs facteurs, y compris la stabilité du substrat (c.-à demi-vie courte), la distribution adéquate de substrat qui dépend de la façon dont elle est livrée à des animaux de laboratoire, et une faible sensibilité de la détection 9. Un mérite principal de cette technique est qu&#39;il est non-invasif, peut être réalisée sur des animaux vivants, et peut conduire à la détection de métastases de cellules tumorales dans des organes multiples qui peuvent ne pas avoir été normalement récoltées à dissection 9,10. Un aspect positif de vivo techniques d&#39;imagerie en est que le tissu pulmonaire est non perturbées permettant procédures secondaires comme inclusion dans la paraffine ou comme présenté ici, l&#39;analyse QRT-PCR. Toutefois, en raison QRT-PCR est theoretically une mesure plus sensible de la détection, l&#39;évaluation brute ne peut révéler un faible nombre de cellules tumorales présentes dans le poumon. Bien qu&#39;utiles, les techniques d&#39;imagerie décrites ci-dessus peuvent être substitués ou complétés par la méthode QRT-PCR actuellement décrit. QRT-PCR a le potentiel de fournir une mesure sensible de l&#39;ARNm d&#39;origine tumorale dans un poumon.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

La maladie métastatique est la propagation des cellules tumorales malignes du site primaire du cancer à un organe éloigné et est la cause principale du cancer du décès associés 1. Des sites communs de dissémination métastatique comprennent poumons, ganglions lymphatiques, le cerveau et la moelle 2. Les mécanismes qui conduisent les métastases sont des zones intenses de recherche sur le cancer. Par conséquent, les dosages efficaces pour mesurer la charge métastatique dans des sites éloignés de métastases sont essentiels pour la recherche sur le cancer. Évaluation des métastases pulmonaires dans des modèles de tumeurs mammaires est généralement effectuée par l&#39;observation qualitative brute de tissu pulmonaire après dissection. Les méthodes quantitatives d&#39;évaluation des métastases sont actuellement limités à ex vivo et des techniques d&#39;imagerie in vivo en fonction nécessitant des paramètres définis par l&#39;utilisateur. Un grand nombre de ces techniques sont au niveau de l&#39;organisme entier plutôt qu&#39;au niveau cellulaire 6.3. Bien que les nouvelles méthodes d&#39;imagerie utilisant la microscopie multi-photons sont en mesure d&#39;évaluer metasTASIS au niveau cellulaire 7, ces procédures très élégantes sont plus adaptés à l&#39;évaluation des mécanismes de diffusion plutôt que l&#39;évaluation quantitative de la charge métastatique. Ici, une méthode in vitro simple d&#39;évaluer quantitativement la métastase est présenté. Utilisation quantitative PCR en temps réel (QRT-PCR), de l&#39;ARNm spécifique de cellules tumorales peut être détecté dans le tissu pulmonaire de souris.

Au-delà du temps nécessaire pour effectuer l&#39;inoculation initiale des cellules tumorales dans l&#39;animal expérimental et si la scène, primaire dans l&#39;analyse de tumeur in vivo, la récolte des tissus, l&#39;isolement de l&#39;ARN et l&#39;analyse QRT-PCR est un procédé de 1-2 jours (Figure 1) . Un exemple d&#39;analyse est l&#39;imagerie bioluminescente brut pour évaluer les ...

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Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Ce protocole décrit l&#39;utilisation quantitative PCR en temps réel (QRT-PCR) pour détecter l&#39;ARNm spécifique de cellules tumorales représentant métastase dans le tissu pulmonaire de souris.

Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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