Name: evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

המעבדה יה נתמכת על ידי מימון מחקר מאגודה אמריקנית לסרטן מוסדי מענק מחקר (IRG-97-219-14) הוענק למרכז הסרטן הולינגס בMUSC, על ידי מימון מחקר ממענק משרד ההגנה (W81XWH-11-2- 0229) בMUSC, ועל ידי פרסים מדאגת הקרן (לESY).

הפרוטוקול כדלקמן הנחיות ותקני טיפול בבעלי החיים של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה (MUSC) והטיפול בבעלי חיים המוסדי שלה וועדת שימוש (IACUC). 1. ריאות Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיחת גידול החלב (אופציונאלי בהתאם ?...

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר שימוש בqRT-PCR להעריך גרורות תאים סרטניים החלב לריאות תוך שימוש במודל עכבר xenograft. הוא הכיר בכך שטכניקות אחרות, כוללים הדמיה bioluminescent, זמינות והם גם יעילים לאיתור גרורה למרות שיש ערכים משלהם ומגבלות. הנתונים שהוצגו עולה כי qRT-PCR מספק אמצעי אפקטיבי של גילוי m...

ניתוח qRT-PCR מוצע כשיטת להערכת גרורות סרטנית. שיטה זו מוצע כאלטרנטיבה עבור משתמשים שמעוניינים בהערכת גרורות אבל אין גישה לציוד ספציפי כגון ציוד ההדמיה in vivo או מסוגל stereoscope הקרינה. דיון בשיטות נפוצות הוא שהוצגו אחרי הפגנה לאיך ניתוח qRT-PCR יכול לשמש גם כנפרד או כשיטת לוויה להעריך גרורות. יש הליך זה הפוטנציאל לספק ניתוח כמותי של נטל גרורתי. שיטות סטנדרטית של ניתוח ברוטו, כוללים הדמיה של ריאות תחת סטראו, כמו גם חתך סידורי אחרי hematoxylin ו eosin מכתים (H &amp; E) של רקמת ריאה, הן לכימות, אך מסתמכות במידה רבה על פרמטרים הגדרת משתמש לספירת 2-5. בעת ההערכה כל ריאות באמצעות סטראו, גרורות משטח רק גדולות הם Visible וניתוח דורש חוקר להיות בעל ידע סביר של מבנה האנטומי ריאות כדי לקבוע מה מהווה נגע גרורתי. תיוג ניאון של תאים סרטניים עם סמן כגון GFP ושימוש בסטראו המכיל קוביית אור עם מקסימום עירור / הפליטה המתאימה (למשל ליד 470/510 ננומטר לGFP) מסייע בתהליך זה, אבל הגושים סרטניים משטח רק לזיהוי . בנוסף, הקרינה מזיהום דם, שהוא נראה באותם פרמטרים כמו GFP, עלולה להוביל לזיהוי שגוי של נגעים גרורתי אפשריים. חתך של הריאה ואחרי צביעת H &amp; E לדמיין גרורות ריאות הוא שיטה שימושית להעריך micrometastases ותהליכים מיקרוסקופיים אחרים, כולל חדירת תאי מערכת חיסון, אך לעתים קרובות דורש שימוש בכל רקמת הריאה להטבעת פרפין, חתך, ונהלים מכתים. לכן, נהלים במורד הזרם אינם אידיאליים הבאים metho זהד. למרות כימות, הליך זה דורש החוקר להעריך במספר רב של סעיפי ריאות מוכתמים לכל בעלי חיים על מנת להבטיח שהניתוח מהווה את כל מבנה 3D של הריאות. כתוצאה מכך, זה סוג של בדיקה הוא לצרוך זמן, יכול להוביל לספירת שגיאה, ומסתמך במידה רבה על ניתוח שיקול דעת חוקר. כמה בטכניקות ההדמיה vivo (למשל MRI, PET, SPECT) משמש כיום לבצע או לבדוק תהליכים ביולוגיים במודלים של מכרסמים ניסיוניים 8. בvivo ההדמיה bioluminescent היא שיטה נפוצה המשמשת לרכישת נוף ברוטו של גרורות 9. טכניקה זו מיושמת בדרך כלל על מנת להעריך את הנוכחות של פעילות העיתונאית לוציפראז בשל ההצטברות של תאים סרטניים, שמתוכננים להכיל אלמנט תגובת לוציפראז, שמתגוררים באיברים מסוימים כמו בלוטת החלב לאחר השתלת תאים סרטניים והריאות על גרורות ספונטניות 10. יזואליזציה של פעילות העיתונאית לוציפראז מושרה על ידי הנוכחות של מצע luciferin (D-luciferin). בלוציפראז מזרז decarboxylation חמצוני של D-luciferin לoxyluciferin יצירת פליטת אור. בעוד אינפורמטיבי, שיטה זו מוגבלת על ידי מספר גורמים, כולל יציבות מצע (כלומר מחצית חיים קצרים), הפצה הולמת של מצע שתלוי איך הוא מועבר לחיות ניסוי, ורגישות נמוכה של גילוי 9. הכשרון עיקרי לטכניקה זו הוא שהיא אינה פולשני, יכולה להתבצע על בעלי חיים, ויכולה להוביל לזיהוי של גרורות תאים סרטניים באיברים רבים שאולי לא נקצר בדרך כלל בנתיחת 9,10. היבט חיובי אחד בvivo טכניקות הדמיה הוא שרקמת הריאה היא באין מפריע ומאפשרת לנהלים משניים כמו הטבעת פרפין או כפי שהוצג כאן, ניתוח qRT-PCR. עם זאת, בגלל qRT-PCR הוא theoretically מדד רגיש יותר של זיהוי, הערכה גולמית עשוי שלא לחשוף את המספרים נמוכים של תאי גידול הנוכחיים בריאות. אמנם שימושי, ניתן להחליף את טכניקות ההדמיה שתוארו לעיל או בתוספת שיטת qRT-PCR תיארה כרגע. יש qRT-PCR הפוטנציאל לספק מידה רגישה של mRNA הנגזר גידול בתוך ריאות.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

מחלה גרורתית היא ההתפשטות של תאי גידול ממאירים מאתר הסרטן הראשוני לאיבר מרוחק, והוא הגורם העיקרי למוות הקשורים לסרטן 1. אתרים נפוצים של התפשטות גרורה כוללים ריאות, בלוטות לימפה, מוח, ועצם 2. מנגנונים המניעים את גרורות אזורים אינטנסיביים של חקר הסרטן. כתוצאה מכך, מבחני יעילים למדידת נטל גרורתי באתרים מרוחקים של גרורות הם אינסטרומנטלי לחקר הסרטן. הערכה של גרורות ריאה במודלים של גידול החלב מבוצעת בדרך כלל על ידי תצפית איכותית ברוטו של רקמת הריאה הבאה לנתיחה. שיטות כמותיות להערכת גרורות כיום מוגבלות לvivo לשעבר ובטכניקות הדמיה מבוססת vivo הדורשות פרמטרים הגדרת משתמש. רב של טכניקות אלה בכל רמת האורגניזם ולא הרמה התאית 3-6. למרות ששיטות הדמיה חדשות יותר ניצול מיקרוסקופיה רב-פוטון מסוגלות להעריך metastasis ברמה התאית 7, נהלים האלגנטיים ביותר שמתאימים יותר להערכת מנגנוני הפצה ולא הערכה כמותית של נטל גרורתי. הנה, שיטה במבחנה פשוטה להעריך כמותית גרורות מוצגת. שימוש בזמן אמת PCR (qRT-PCR), mRNA הספציפי תאים סרטניים יכול להתגלות בתוך רקמת הריאה עכבר.

מעבר לזמן שנדרש כדי לבצע את החיסון הראשוני של תאי גידול לבעלי החיים הניסיוניים ואם ביצוע, עיקרי בניתוח גידול vivo, קציר הרקמות, בידוד RNA, וניתוח qRT-PCR הוא הליך 1-2 יום (איור 1) . דוגמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בזמן אמת PCR (qRT-PCR) כדי לזהות mRNA הספציפי תאים סרטניים המייצג גרורות בתוך רקמת הריאה עכבר.

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

בתחום ההדמיה vivo של פליטת אור Dynamics היפוקסיה גידול של גרורות סרטן השד המוח במודל של עכברים

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Models of Bone Metastasis

מודלים של גרורות עצם

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

שיטה פשוטה של ​​אינטובציה ריאות המאוסות

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

חניכה של סרטן השד גרורתי על ידי מיקוד של האפיתל ductal עם Adenovirus-Cre: דגם רומן מהונדס עכבר של סרטן השד

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...