Name: evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Il laboratorio Yeh è sostenuto da fondi per la ricerca da un American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) assegnato alla Hollings Cancer Center presso MUSC, da finanziamenti per la ricerca da un Dipartimento della Difesa di sovvenzione (W81XWH-11-2- 0229) a MUSC, e un premio dalla Fondazione Concern (a ESY).

Il protocollo segue le linee guida e gli standard di cura degli animali della Medical University of South Carolina (MUSC) e la sua Animal Care istituzionali e del Comitato uso (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Mammaria dissezione del tumore (opzionale a seconda degli obiettivi di studio e se analisi tumore primario o coda vena iniezione è stata eseguita). <ol><li> Euthanize mouse utilizzando una dose letale di anestesia isoflurano secondo IACUC e regolamentazione università. Confermare euthanization da lu...

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

Questo protocollo descrive l&#39;uso di QRT-PCR per valutare mammaria le metastasi delle cellule tumorali al polmone utilizzando un modello murino di xenotrapianto. Si riconosce che altre tecniche, tra cui l&#39;imaging bioluminescente, sono disponibili e sono anche efficaci per la rilevazione di metastasi pur avendo i propri valori e limiti. I dati presentati indicano che QRT-PCR fornisce una misura efficace di rilevamento dell&#39;mRNA derivate da tumore all&#39;interno di tessuto polmonare per la quantificazione dell...

Analisi RT-PCR si propone come un metodo per valutare metastasi tumorali. Questo metodo si propone come alternativa per gli utenti che sono interessati a valutare le metastasi, ma non possono avere accesso alle attrezzature specifiche quali attrezzature imaging in vivo o una fluorescenza stereoscopio capace. Una discussione dei metodi comunemente usati è presentato seguita da una dimostrazione di come l&#39;analisi RT-PCR può essere usato sia come separato o come un metodo per valutare guidata metastasi. Questa procedura ha il potenziale per fornire un&#39;analisi quantitativa di carico metastatico. Metodi standard di analisi lordo, tra cui la visualizzazione dei polmoni allo stereomicroscopio nonché sezionamento seriale seguita da ematossilina eosina (H &amp; E) la colorazione del tessuto polmonare, sono quantificabili ma fanno molto affidamento su parametri definiti dall&#39;utente per il conteggio 2-5. Nel valutare i polmoni interi utilizzando uno stereomicroscopio, solo le grandi metastasi di superficie sono visibile e analisi richiede l&#39;investigatore di avere ragionevole conoscenza della struttura anatomica del polmone a determinare ciò che costituisce una lesione metastatica. Marcatura fluorescente di cellule tumorali con un marcatore, come GFP e l&#39;uso di uno stereomicroscopio che contiene un cubo di luce con i massimi appropriata di eccitazione / emissione (ad esempio vicino 470/510 nm per GFP) aiuta in questo processo, ma solo noduli tumorali superficie sono rilevabili . Inoltre, la fluorescenza dalla contaminazione del sangue, che è visibile sotto gli stessi parametri GFP, può portare a false identificazione di possibili lesioni metastatiche. Sezionamento del polmone seguita da colorazione H &amp; E di visualizzare metastasi polmonari è un metodo utile per valutare micrometastasi e altri processi microscopici, tra cui l&#39;infiltrazione di cellule immunitarie, ma spesso richiede l&#39;uso di tutto il tessuto polmonare per paraffina, sezionamento, e procedure di colorazione. Pertanto, le procedure a valle non sono ideali seguendo questo method. Sebbene quantificabile, questa procedura richiede al ricercatore di valutare un gran numero di sezioni polmonari colorate per animale per garantire che l&#39;analisi dei bilanci dell&#39;intera struttura 3D del polmone. Di conseguenza, questo tipo di esame è molto tempo, può portare ad errori di conteggio e analisi dipende fortemente investigatore discrezione. Diversi in tecniche di imaging in vivo (ad esempio la risonanza magnetica, PET, SPECT) sono attualmente utilizzate per eseguire o testare i processi biologici in modelli di roditori sperimentali 8. Imaging in vivo bioluminescente è un metodo comune utilizzato per acquisire una visione lordo di metastasi 9. Questa tecnica è generalmente applicato per valutare la presenza di attività della luciferasi dovuto all&#39;accumulo di cellule tumorali, che sono progettati per contenere un elemento di risposta luciferasi, che risiedono in organi specifici come la ghiandola mammaria dopo l&#39;impianto delle cellule tumorali e il polmone su metastasi spontanea 10. La visualizzazione di attività della luciferasi è indotta dalla presenza del substrato luciferina (D-luciferina). Luciferasi catalizza la decarbossilazione ossidativa di D-luciferina per oxyluciferin generare bioluminescenza. Mentre informativo, questo metodo è limitata da diversi fattori tra cui la stabilità del substrato (es emivita breve), adeguata distribuzione di substrato, che dipende da come viene consegnato a animali da esperimento, e la bassa sensibilità di rilevazione 9. Un merito principale di questa tecnica è che è non invasivo, può essere eseguita su animali vivi, e può portare alla rilevazione di metastasi delle cellule tumorali in diversi organi che non può essere normalmente raccolte a dissezione 9,10. Un aspetto positivo delle tecniche di imaging in vivo è che il tessuto polmonare è indisturbato permettendo per le procedure secondari come paraffina o come presentato qui, analisi QRT-PCR. Tuttavia, poiché QRT-PCR è Theoretically una misura più sensibile di rilevazione, la valutazione lordo non può rivelare un basso numero di cellule presenti nel polmone tumore. Mentre utile, le tecniche di imaging sopra descritti possono essere sostituiti o integrati con il metodo RT-PCR attualmente descritto. QRT-PCR ha il potenziale per fornire una misura sensibile di mRNA derivate da tumore all&#39;interno di un polmone.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

La malattia metastatica è la diffusione delle cellule tumorali maligne dal sito cancro primario di un organo lontana ed è la causa primaria di cancro associato alla morte 1. Comuni sedi di diffusione metastatica includono polmone, linfonodi, cervello, ossa e 2. Meccanismi che guidano le metastasi sono zone intense di ricerca sul cancro. Di conseguenza, le analisi efficaci per misurare onere metastatico in siti distanti di metastasi sono strumentali per la ricerca sul cancro. Valutazione delle metastasi polmonari in modelli di tumore mammario viene generalmente effettuata attraverso l&#39;osservazione qualitativa lordo del tessuto polmonare dopo dissezione. Metodi quantitativi per valutare le metastasi si limitano attualmente ex vivo e in tecniche di imaging basato vivo che richiedono parametri definiti dall&#39;utente. Molte di queste tecniche sono al di organismo intero piuttosto che il livello cellulare 3-6. Anche se i metodi di imaging più recenti che utilizzano la microscopia multi-fotone sono in grado di valutare metastasiTASIS a livello cellulare 7, questi altamente eleganti procedure sono più adatti a valutare i meccanismi di diffusione piuttosto che la valutazione quantitativa degli oneri metastatico. Qui, un semplice metodo in vitro per valutare quantitativamente metastasi è presentato. Utilizzando quantitativa Real-time PCR (QRT-PCR), cellule tumorali mRNA specifico può essere rilevato all&#39;interno del tessuto polmonare del mouse.

Al di là del tempo necessario per eseguire l&#39;inoculazione iniziale di cellule tumorali in animali sperimentali e se si esegue, in analisi primaria del tumore in vivo, la raccolta dei tessuti, isolamento dell&#39;RNA, e l&#39;analisi RT-PCR è una procedura 1-2 giorni (figura 1) . Un esempio di analisi lordo è l&#39;imaging bioluminescente valutare cellule tumorali nel tessuto polmonare....

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Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Questo protocollo descrive come utilizzare quantitativa Real-time PCR (QRT-PCR) per rilevare l&#39;mRNA specifici di cellule tumorali rappresentano metastasi all&#39;interno del tessuto polmonare del mouse.

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

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