Name: evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00
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葉ラボは、米国癌協会の制度研究助成（IRG-97-219-14）国防総省の助成金から研究資金により、MUSCでHollingsがんセンターに授与（W81XWH-11-2-から研究資金によってサポートされています0229） MUSCで、と懸念（ESY）は財団から賞を受賞することによって。

プロトコルは、サウスカロライナ医科大学（MUSC）とその施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインや動物のケアの標準に準拠しています。 1.肺解剖<ol><li>乳腺腫瘍解剖（オプションの研究の目標にし、原発腫瘍の解析または尾静脈注射が行われたかどうかによって異なります）。 <ol><li> IACUCと大学の規則に従ってイソフルラン麻酔の致死量を使用して、マウスを安楽死させま?...

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

このプロトコルは、異種移植マウスモデルを使用して肺に乳腺腫瘍細胞の転移を評価するために、QRT-PCRの使用を記載しています。それは、生物発光イメージングを含む他の技術は、利用可能であり、また、自分の価値観と限界を持つにもかかわらず、転移を検出するために有効であることが認められています。提示されたデータは、QRT-PCRは、総転移の定量のための肺組織内の腫瘍由来のmRNA?...

QRT-PCR分析は、腫瘍の転移を評価する方法として提案されています。この方法は、転移の評価に興味を持っているが、このようなin vivoイメージング機器や蛍光できるステレオスコープのような特定の機器へのアクセス権を持っていない可能性があり、ユーザーのための代替として提案されています。一般的に使用される方法の議論は、QRT-PCR分析は、分離してまたは転移を評価するためのコンパニオン方法としても使用することができる方法を実証するために続いて提示されます。この手順は、転移性負荷の定量的な分析を提供する可能性を有します。 実体顕微鏡下での肺の可視化だけでなく、肺組織のヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を行った連続切片を含む総分析の標準的な方法は、定量化可能であるが、2-5をカウントするためのユーザー定義のパラメータに大きく依存しています。実体顕微鏡を用いて全肺を評価する際に、唯一の大きな表面転移がVISIですBLEと分析は、転移性病変を構成するものを決定するために、肺の解剖学的構造の合理的な知識を持っている研究者を必要とします。例えば、GFP（例えば、GFPのための510分の470 nm付近）適切な励起/発光極大を持つ光キューブが含まれている実体顕微鏡の使用などのマーカーによる腫瘍細胞の蛍光標識、このプロセスを支援するが、表面だけの腫瘍結節が検出可能です。さらに、GFPと同じパラメータの下に表示されている血液汚染からの蛍光は、可能な転移病変の偽の身分証明書につながる可能性があります。 肺転移を可視化するために、H＆E染色に続いて肺の切片は、微小転移および免疫細胞の浸潤を含む他の微細なプロセスを評価するための有用な方法であるが、多くの場合、肺全体のパラフィン包埋のための組織、切片、および染色手順を使用する必要があります。そのため、下流の手順は、このメト次理想的ではありませんD。定量化が、この手順では、分析は、肺の全体の三次元構造を考慮していることを確認するために、動物あたり染色した肺切片の多数を評価するために研究者が必要となります。その結果、検査のこのタイプは時間がかかり、エラーをカウントにつながることができ、解析は研究者の裁量に大きく依存しています。 イメージング技術（例えば、MRI、PET、SPECT）は、現在、実験的なげっ歯類モデル8の生物学的プロセスを実行またはテストするために使用され、インビボでのいくつかの。 インビボでの生物発光イメージングは、転移9の全体のビューを取得するために使用される一般的な方法です。この技術は、一般に、腫瘍細胞移植後の乳腺および自然転移の際に肺のような特定の器官に存在するルシフェラーゼ応答エレメントを含むように操作された腫瘍細胞の蓄積を、ルシフェラーゼレポーター活性の存在を評価するために適用されます10。ルシフェラーゼレポーター活性の可視化は、ルシフェリン基質（D-ルシフェリン）の存在によって誘導されます。ルシフェラーゼは、生物発光を生成するオキシルシフェリンするD-ルシフェリンの酸化的脱炭酸を触媒します。有益ながら、この方法は、基板の安定性（ すなわち、短い半減期）、それが実験動物に送達されるかに依存して、基板の適切な分布、および検出9の低い感度を含むいくつかの要因によって制限されます。この手法の主な利点は、それが非侵襲性であるということである生きた動物に対して行うことができ、通常は解剖9,10で収穫されていない可能性があり、複数の臓器における腫瘍細胞の転移の検出をもたらすことができます。 インビボイメージング技術の一つの正の側面は、肺組織をQRT-PCR分析を、パラフィン包埋のような二次的処置のために、またはここに提示させること乱されることです。しかし、QRT-PCRはtheoreticaあるためLLY検出のより感度の高い測定、総評価は、肺に存在する腫瘍細胞の低い数字を明らかにしないことがあります。有用であるが、上述の画像化技術は、現在記載QRT-PCR法を用いて、置換または補充することができます。 QRT-PCRは、肺内の腫瘍由来のmRNAの高感度測定を提供する可能性を有します。

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

転移性疾患は、遠隔臓器への癌原発部位から悪性腫瘍細胞の広がりであり、癌関連死1の主な原因です。転移拡散の一般的な部位は、肺、リンパ節、脳、および骨2が含まれます 。転移を駆動機構は癌研究の激しい領域です。その結果、転移の離れた部位に転移性の負担を測定するための効果的なアッセイは、癌研究のために尽力しています。乳房腫瘍モデルにおける肺転移の評価は、一般的に解剖後の肺組織の肉眼定性的観察することによって行われます。転移を評価する定量的方法は、現在、 エキソビボおよびユーザ定義のパラメータを必要とするインビボイメージングに基づく技術に限定されています。これらの技術の多くは、生物全体のレベルではなく、細胞レベル3-6です。多光子顕微鏡法を利用し、新しい画像形成方法は、メタ情報を評価することが可能であるが細胞レベル7でtasis、これらの非常にエレガントな手順は、普及のメカニズムではなく、転移性負荷の定量的評価を評価するのにより適しています。ここでは、定量的に転移を評価するための簡単なインビトロ方法が提供されます。腫瘍細胞特異的mRNAは、マウスの肺組織内で検出することができ、定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）を使用。

それは、インビボの腫瘍の分析で一、実験動物へと行った場合に、腫瘍細胞の最初の接種を行うために要する時間を超えて、組織採取、RNA単離、およびQRT-PCR分析（図1）1-2日間の手順であります。 総分析の例は、肺組織内の腫瘍細胞を評価するための生物発光イメージングです。ここでは、乳腺?...

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Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

このプロトコルは、マウスの肺組織内の転移を示す腫瘍細胞特異的mRNAを検出するための定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）を使用する方法について説明します。

定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

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マウスモデルにおける乳がんの脳転移の腫瘍の低酸素動態の in vivo生物発光イメージングに

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

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定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

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骨転移モデル

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A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

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定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

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Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...