Name: evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Den Yeh lab er støttet av forskningsmidler fra en American Cancer Society Institutional stipend (IRG-97-219-14) tildeles den Hollings Cancer Center ved MUSC, av forskningsmidler fra en Department of Defense tilskuddet (W81XWH-11-2- 0229) på MUSC, og med en pris fra Concern Foundation (til ESY).

Protokollen følger de retningslinjer og dyr omsorg standarder for Medical University of South Carolina (MUSC) og dens Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Brysttumor disseksjon (valgfritt avhengig av studiemål og om primærtumor analyse eller halevenen injeksjon ble utført). <ol><li> Avlive mus bruker en dødelig dose av isoflurananestesi ifølge IACUC og universitet regulering. Bekreft euthanization ved kirurgisk forvridning. </li><li> På skum bord, pin med diss...

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

Denne protokollen beskriver anvendelse av QRT-PCR for å evaluere brysttumorcellemetastasering til lungen ved hjelp av en xenograft musemodell. Det erkjennes at andre teknikker, inkludert selvlysende avbildning, er tilgjengelige og er også effektive for detektering av metastasering til tross for å ha sine egne verdier og begrensninger. Dataene presenteres antyder at QRT-PCR gir et effektivt tiltak for å påvise tumor-avledet mRNA innenfor lungevev for kvantifisering av total metastaser. Det er foreslått at QRT-PCR-a...

QRT-PCR-analyse er foreslått som en metode for vurdering av tumormetastase. Denne metoden er foreslått som et alternativ for brukere som er interessert i å vurdere metastaser, men kanskje ikke har tilgang til spesielle utstyr som for eksempel in vivo imaging utstyr eller en fluorescens stand stereoskop. En diskusjon av brukte metodene er presentert etterfulgt av en demonstrasjon for hvordan QRT-PCR-analyse kan brukes enten som en separat eller som en følges metode for å evaluere metastaser. Denne fremgangsmåten har potensial til å gi en kvantitativ analyse av metastatisk belastning. Standard metoder for grov analyse, inkludert visualisering av lungene under en stereo samt serie seksjonering fulgt av hematoxylin og eosin (H &amp; E) farging av lungevev, er kvantifiserbare men avhengige av brukerdefinerte parametere for telling 2-5. Når man skal vurdere hele lungene ved hjelp av et stereomikroskop, bare store overflatemetastaser er visigjengelig og analyse krever etterforskeren skal ha rimelig kjennskap til lunge anatomiske strukturen for å avgjøre hva som utgjør en metastatisk lesjon. Fluorescerende merking av tumorceller med en markør slik som GFP og bruk av et stereomikroskop som inneholder en lys kube med det passende eksitasjon / emisjon maksima (f.eks nær 470/510 nm for GFP) hjelper til med denne prosessen, men bare overflate tumorknuter kan påvises . I tillegg fluorescens fra blodsmitte, som er synlig under de samme parametrene som GFP, kan føre til falsk identifikasjon av mulige metastatiske lesjoner. Seksjonering av lungen fulgt av H &amp; E farging for å visualisere lungemetastase er en nyttig metode for å evaluere mikrometastaser og andre mikroskopiske prosesser, inkludert immuncelleinfiltrasjon, men krever ofte bruk av hele lungevev for parafin innebygging, snitting og fargingsprosedyrer. Derfor nedstrøms prosedyrer er ikke ideelt å følge denne method. Selv om det er kvantifiserbar denne fremgangsmåten krever undersøkeren for å evaluere et stort antall fargede lungeseksjoner per dyr for å sikre at analysen står for hele 3D-strukturen til lungen. Derfor denne type undersøkelse er tidkrevende, kan føre til tellefeil, og analysen er veldig avhengig etterforsker skjønn. Flere i vivo imaging teknikker (f.eks MRI, PET, SPECT) blir i dag brukt til å utføre eller teste biologiske prosesser i eksperimentelle gnagermodeller 8. In vivo bioluminescent bildediagnostikk er en vanlig metode som brukes for å skaffe seg en brutto visning av metastase 9. Denne teknikken blir vanligvis brukt for å evaluere tilstedeværelsen av luciferase reporter-aktivitet på grunn av opphopning av tumorceller, som er konstruert for å inneholde en luciferase responselement, som befinner seg i bestemte organer som juret etter tumorcelle implantasjon, og lungen ved spontan metastase 10. Visualisering av luciferase reporter-aktivitet er indusert ved nærværet av luciferin substrat (D-luciferin). Luciferase katalyserer den oksydative dekarboksylering av D-luciferin for å generere oxyluciferin bioluminescens. Mens rikt, er denne metoden begrenset av flere faktorer, inkludert substrat stabilitet (dvs. kort halveringstid), tilfredsstillende fordeling av substrat som avhenger av hvordan det er levert til forsøksdyr, og lav følsomhet for deteksjon 9. En hoved fortjeneste til denne teknikken er at den er ikke-invasiv, kan utføres på levende dyr, og kan føre til påvisning av tumorcellemetastaser i flere organer som kanskje ikke har vært normalt høstet ved disseksjon 9,10. En positiv side ved in vivo imaging teknikker er at lungevevet er uforstyrret åpner for sekundære prosedyrer som parafin innebygging eller som presenteres her, QRT-PCR-analyse. Men fordi QRT-PCR er theoretically et mer følsomt mål på gjenkjenning, kan brutto evalueringen ikke avsløre lavt antall kreftceller til stede i lungen. Mens nyttig, kan bildeteknikker beskrevet ovenfor erstattes eller suppleres med QRT-PCR-metoden for tiden beskrevet. QRT-PCR har potensiale for å tilveiebringe et følsomt mål på tumor-avledede mRNA i en lunge.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

Metastatisk sykdom er spredningen av maligne tumorceller fra primærcancer området til en fjernt organ, og er den primære årsak til kreft assosiert død 1. Vanlige områder av metastatisk spredning inkluderer lunge, lymfeknute, hjerne og bein 2. Mekanismene som driver metastase er intense områder av kreftforskning. Følgelig til effektive analyser måle metastatisk belastning i fjerne områder av metastaser er instrumental for kreftforskning. Evaluering av lungemetastaser i brysttumormodeller er vanligvis utført av brutto kvalitativ observasjon av lungevev etter disseksjon. Kvantitative metoder for evaluering av metastaser er foreløpig begrenset til ex vivo og in vivo bildebaserte teknikker som krever brukerdefinerte parametere. Mange av disse teknikkene er at hele organismen nivå enn cellenivå 3-6. Selv nyere avbildningsmetoder utnytte multi-foton mikroskopi er i stand til å vurdere metastasis på cellenivå 7, disse svært elegante prosedyrer er mer egnet til å vurdere mekanismer for formidling fremfor kvantitativ vurdering av metastatisk byrde. Her blir en enkel in vitro-metode for å kvantitativt vurdere presenteres metastase. Ved hjelp av kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR), kan tumorcelle bestemt mRNA oppdages innen musen lungevevet.

Utover den tiden det tar å utføre den innledende inokulering av tumorceller inn i forsøksdyr, og hvis utførelse, primær in vivo tumor-analyse, vevet avling, RNA isolering, og QRT-PCR-analyse er en 1-2 dagers prosedyre (Figur 1) . Et eksempel på brutto analyse er selvlysende avbildning for å vurdere tumorceller i lungevevet. Her ble en bryst tumorigenesis eksperiment utført for å vurdere om en...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Denne protokollen beskriver hvordan du bruker kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) for å oppdage svulsten celle spesifikke mRNA som representerer metastaser innen musen lungevevet.

Evaluering av Lung metastaser i Mouse Brysttumormodeller av kvantitativ real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MikroRNA Detection i prostatakreft ved Kvantitativ Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Models of Bone Metastasis

Modeller for Bone Metastase

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Lever Imaging of Drug Responses i svulsten mikromiljøet i musemodeller av Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Bruke kvantitativ real-time PCR fastslår Donor Cell engraftment i en konkurransedyktig Murine benmargstransplantasjon Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

En enkel metode for Mouse Lung Intubasjon

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Innvielse av metastatisk brystkreft ved målretting av Ductal Epitel med Adenovirus-Cre: A Novel transgene mus modell av brystkreft

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Cerebrospinalvæsken MikroRNA Profilering Bruke Kvantitativ Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Primær Tumor og MEF Cell Isolation å studere Lung Metastase

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...